PP333处理对休眠期山药珠芽内源激素的影响

魏灵敏， 段延碧， 龙雯虹， 张雪梅， 孟金贵

(1.云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201； 2.云南农业大学农科实验教学示范中心，云南昆明 650201； 3.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201)

山药(Dioscoreaopposita)是我国大众化菜药兼用的滋补食品，药用价值高，有健脾、固精、补肺、益肾的功能[1]。生产上用茎段进行繁殖，繁殖系数低，生产成本高。赵冰等对山药栽培特性进行观测，发现只有用珠芽对山药进行更新复壮，才可解决山药长期栽培后出现种性退化的问题，但珠芽发芽需数月之久，影响生产上的适时播种[2]。

通常认为，休眠由内源激素控制，休眠的起始、终止和调控以及休眠阶段的各层次变化均受激素调节[3]。前人对山药珠芽的激素调控进行了一定的研究，龙雯虹等探索出用多效唑针刺珠芽中部可促进珠芽发芽，并用不同浓度的多效唑和矮壮素水溶液处理不同休眠期的山药珠芽，证明了1～10 mg/L 多效唑水培能显著打破采后60 d的珠芽休眠[4]；在此基础上，王军民等用多效唑和氯吡脲配施对山药珠芽及中后期长势的影响进行了相关研究[5]；苗丽娟等发现2%和5%的双氧水促进收获后60 d的珠芽提早出芽[6]；另外，龙雯虹等分别测定了不同生长阶段的山药珠芽内源激素IAA、ZR、DHZR、GA3和ABA的含量，探讨了GA3/ABA的比值变化，发现生长期ZR的含量变化大，且GA3含量较高[7]，并对珠芽休眠期内源激素含量做了相关研究，证明珠芽发芽需要GA3含量降低和ZR含量升高，PP333使GA3含量下降速度加快，缩短了珠芽的休眠期[8]。

前人用10 mg/L的PP333处理珠芽后对内源激素GA3的含量进行了测定[8]，但仍不能解释PP333等生长抑制剂对休眠期珠芽效应不同的现象。同时，珠芽的休眠是由萌发抑制物和生长促进物间的平衡所决定，为此该研究测定了不同浓度PP333处理后休眠期珠芽的赤霉素(GA3)、细胞分裂素异戊烯基腺苷(iPA)、玉米素核苷(ZR)和二氢玉米素核苷(DHZR)含量变化，并对激素间的平衡关系进行了探讨，旨在探索出休眠期珠芽内源激素的变化规律及对多效唑的响应，为将来研究对珠芽进行外源激素的调控打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛尾山药种苗来源于云南省禄丰县，选取当年无病虫害、饱满的山药珠芽为试验材料。

1.2 PP333处理山药珠芽

将收获后放于室内60 d的珠芽用多菌灵500倍液浸泡10 min后用清水洗净，擦干珠芽表面水分，用5、25、45、65、85 mg/L PP333溶液浸泡珠芽24 h后，取出珠芽装于培养皿，用湿润蛭石培养。以蒸馏水处理作对照，每处理100粒珠芽，重复3次。每隔7 d随机各取5粒珠芽，切碎混匀后置入液氮中冷冻15 min后，放入-20 ℃冰箱以备测定内源激素iPA、ZR、DHZR、GA3的含量，取样直到珠芽发芽为止。

1.3 内源激素含量测定

激素的提取方法：称取样品0.5～1.0 g，在弱光和冰浴条件下，加入2 mL 80%甲醇提取液(含1 mmol/L二叔丁基对甲苯酚)研磨成浆，转入离心管中，再用3 mL提取液洗研钵3次，4 ℃提取4 h，其间手动摇离心管数次；4 h后4 ℃下 3 500 r/min、离心8 min，取上清液转入10 mL定容瓶中，剩下残渣用3 mL提取液4 ℃下提取1 h，离心后取上清液转入 10 mL 定容瓶中，将剩下残渣用2 mL提取液提取、离心，合并所有上清液，定容至10 mL，即得激素提取液。

激素的测定方法：取1 mL提取液-氮气吹干-样品稀释液溶解-用酶联免疫吸附法(ELISA)测定激素，测定方法和试剂盒由中国农业大学化控中心提供。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel软件和SPSS软件进行处理和分析。

式中：N为测定浓度；V2为提取液总体积；V3为定容稀释液体积；B为稀释倍数；V1为真空浓缩上清液体积；W为植物样品鲜质量(g)。

2 结果与分析

2.1 休眠期至生长期内源激素含量变化

如图1所示，GA3和ZR含量变化呈现“下降—上升—下降—上升”的趋势，iPA和DHZR含量经历了2个波峰后，最后均呈现出上升的趋势。至培养7 d时，DHZR、ZR和iPA的含量均出现下降；在7～21 d时，ZR和GA3含量呈现急速的下降趋势，iPA和DHZR含量则经历了1个波峰，且在21 d时，iPA和DHZR含量与它们最开始的激素水平相持平；在休眠后期(21～35 d)，GA3含量随着休眠的深入而不断升高，DHZR、ZR和iPA的含量呈波动式上升；在萌芽期(35～42 d)，除iPA含量上升外，其他激素含量均下降到最低值；在生长期(42～56 d)，4种激素含量表现出明显的上升趋势，且在56 d均达到了峰值；ZR含量在整个休眠期至生长期始终远高于DHZR、GA3和iPA的含量。

2.2 休眠期至生长期内源激素含量比值的动态变化

如图2所示，在休眠期(0～35 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值呈现“下降—上升—下降”的趋势；在萌芽期(35～42 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值均呈现上升的趋势，其中iPA/GA3比值上升最为明显，由此可知，培养35～42 d时GA3含量的下降，促使iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3的比值回升，促进了休眠的解除。在生长期(42～56 d)，随着GA3含量的快速上升，激素间的比值则快速下降。

在休眠期至生长期，GA3与iPA含量呈正相关，相关系数是0.574；ZR与GA3含量呈显著正相关，相关系数是 0.894；ZR与iPA、iPA与DHZR、ZR与DHZR、GA3与DHZR含量均呈不相关，表明它们之间关系不紧密。

2.3 PP333处理后内源激素含量的动态变化

如图3所示，DHZR含量在培养14 d达到高峰，但随后迅速下降，在21～35dDHZR含量有较小的起伏；在35～42d时，85 mg/L PP333处理呈现大幅度的上升，且高于其他处理的含量，这一阶段其他处理没有明显变化。方差分析表明，相同浓度的处理在不同时期珠芽DHZR含量差异极显著(F=4.741，P=0.000<0.01)；同时期不同浓度处理间DHZR含量差异不显著。

在PP333处理0～7 d，45～65 mg/L的PP333处理ZR含量呈现上升趋势，其余处理则呈现下降趋势；在休眠中期(7～21 d)，除85 mg/L PP333处理经历了1个波峰外，这一阶段其他处理则急速下降至最低值；在萌芽期(35～42 d)，45 mg/L PP333和85 mg/L PP333处理呈现大幅度的上升，这一阶段其他处理表现为下降趋势；在休眠破除时(42 d)，所有处理的含量均高于对照，说明PP333对ZR含量有一定的促进作用。方差分析表明，相同浓度的处理在不同时期珠芽的ZR含量差异极显著(F=11.825，P=0.000<0.01)；同时期不同浓度处理间ZR含量差异不显著。

经PP333处理过的珠芽iPA含量在休眠中期(7～21 d)表现为“低浓度促进、高浓度抑制”的趋势；在萌芽期(35～42 d)，所有处理均呈现大幅度的上升。方差分析表明，同时期不同浓度处理间iPA含量差异不显著；相同浓度处理在不同时期珠芽的iPA含量差异显著(F=2.561，P=0.017<0.05)。

经5～65 mg/L PP333处理的珠芽GA3含量在0～21 d均表现下降趋势，这可能是因为PP333的作用机理是抑制植物内部GA3的产生。在休眠后期(21～35 d)，5～65 mg/L PP333的处理均经历了1个波峰，对照在这一阶段持续上升；在萌芽期(35～42 d)，GA3保持低含量水平；在生长期(42～56 d)，全部处理GA3含量呈现快速的上升趋势。方差分析表明，相同浓度的处理在不同时期珠芽的GA3含量差异极显著(F=7.019，P=0.000<0.01)；同时期不同浓度处理间GA3含量差异不显著。

2.4 PP333处理后内源激素间比值的动态变化

如图4所示，各处理的激素比值变化趋势基本一致，在培养0～21 d时，DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均出现大幅度上升；在休眠中期(21～35 d)，4种激素之间比值继续下降，由于生长促进类激素iPA、DHZR含量下降到较低水平，GA3含量此时呈现缓慢上升的趋势，使得DHZR/GA3、iPA/GA3比值基本小于1，此时ZR/GA3的比值呈现先下降后上升的趋势，为珠芽的萌发做准备；在萌芽期(35～42 d)，GA3含量缓慢下降，使DHZR/GA3和iPA/GA3的比值有回升趋势；在生长期(42～56 d)， DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均表现出不同程度的下降趋势，这可能是生长期间GA3含量远高于ZR、iPA、DHZR的含量而导致的结果。

珠芽激素(iPA+ZR+DHZR)/GA3的比值在休眠期至生长期经历了2个波峰，在休眠期(0～28 d)，所有处理均呈上升趋势，而在处理14～21 d 85 mg/L PP333处理(iPA+ZR+DHZR)/GA3比值低于其他处理的比值，在处理42 d时，85 mg/L PP333处理比值远高于其他处理。由此可知，PP333在休眠期能促进细胞分裂素含量的增加，以85 mg/L PP333处理的效果最为明显，其他浓度PP333处理的激素比值则与对照的比值差异不显著。

3 结论与讨论

3.1 内源激素与珠芽休眠萌发的关系

该试验结果表明，iPA含量变化与山药珠芽的发育过程相一致。休眠期iPA含量一直较低，原因可能是休眠的珠芽在聚集能量以抵御寒冷的气候和为珠芽提供过冬的营养物质，又或者iPA可能并未直接参与休眠的解除。在生长期iPA含量急速上升，由此猜测iPA的作用在于珠芽解除休眠后的萌发生长。经初步分析，iPA含量增加是因为营养需求增加，反之亦然。

种子休眠的解除总是与赤霉素类物质的积累相伴发生[9]。未经PP333处理的珠芽GA3含量经历先升再降最后升高的过程，在休眠期低温促进了GA3的合成，促使GA3含量的持续升高，这与龙雯虹等的研究[10]一致，而经PP333处理的珠芽经历了下降再升高的过程，即PP333抑制休眠期GA3的升高，而休眠解除时GA3含量达最低值，这一结果与前人研究GA3抑制珠芽发芽的结论[11-12]一致，至生长期GA3含量升高，可能是因为GA3需较高水平才有利于种子细胞分裂、伸长和种子发育所需的养分吸收[13]，因此GA3在珠芽的休眠期至生长期起着双重作用，即先抑制萌发、后促进生长，有关这一现象的内在机理还需进一步探索。

ZR具有抵消萌发抑制物质、调控种子发育中的物质和能量代谢的作用[14]。本试验结果表明，ZR含量随着休眠程度的加深而增加，由此推测ZR在休眠期加快了细胞分裂分化的速度，加厚了珠芽的外皮，提高了对珠芽的保护能力。在休眠期DHZR、GA3和iPA含量上升的作用是促进细胞分裂，高含量的生长促进类激素ZR迅速降低减少了对GA3的制约，使GA3在珠芽的休眠中发挥主要作用。随着休眠的解除，ZR含量快速上升，此时，细胞分裂素可能促进细胞分裂和扩大，诱导了珠芽的分化。因此，ZR能够克服萌发抑制的因子，解除休眠，促进珠芽的萌发。

DHZR含量在休眠至萌发期较其他激素低，休眠期DHZR含量上升是为了聚集能量，休眠后期的缓慢下降可能是受到低温和GA3共同抑制作用。

3.2 珠芽休眠期至萌发期内源激素间的平衡关系

由内源激素间比值变化可以看出，较低的DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3比值有利于休眠。其中DHZR/GA3和iPA/GA3通过低比值减少对休眠的抑制，从而对休眠发挥间接的调控作用。ZR/GA3比值进入休眠期迅速下降，休眠后期又明显回升，与休眠进程相一致，因此认为ZR与GA3间的平衡变化对休眠的调控起主要作用。

根据内源激素间的相关性分析，iPA与GA3、ZR与GA3的相关性较紧密，且iPA/GA3和ZR/GA3比值变化趋势相同，说明GA3解除休眠作用与内源激素平衡有关，但内源激素之间具体的协同作用机理有待进一步研究。

3.3 PP333对珠芽内源激素的影响

本试验发现，5～65 mg/L PP333处理的珠芽和对照同时萌发，在解除休眠期85 mg/L PP333处理的珠芽GA3含量最低，这一变化使处理比对照提前7 d发芽，这与龙雯虹等研究的PP333处理能加快珠芽休眠后期GA3含量下降的速度，使珠芽提前发芽的结论[8]相一致，也与王鹏等在马铃薯的休眠研究中认为GA3在调节萌发和解除休眠时起重要作用，抑制剂和细胞分裂素起辅助作用的结论[15]一致。同时，萌发期不一致或许是珠芽对不同浓度PP333处理的感应程度不同。

经PP333处理的珠芽ZR含量在萌芽期均高于对照，GA3含量在休眠期均低于对照，说明PP333有助于提高萌芽期ZR含量，降低休眠期GA3含量。通过内源激素间的比值关系，可以看出山药珠芽的休眠进程取决于多种内源激素的平衡，而不是取决于单一激素的含量，所以笔者认为山药珠芽促成栽培的研究不应仅仅局限于通过施用外源PP333解除珠芽休眠，而应充分利用其他植物激素，同时重视对外部环境因素综合而深入的研究，寻求打破山药珠芽休眠的有效方法，从而促进山药的周年商业生产。

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