牛尾菜种子后熟调控

冯 颖， 张金秋， 顾地周， 孙忠林， 苗婷婷

(通化师范学院生命科学学院/吉林省长白山植物种质资源保护与利用重点实验室，吉林通化 134002)

牛尾菜(SmilaxripariaDC)别称鞭鞘子菜、鞭杆菜、千层塔，属于百合科菝葜属草质藤木多年生宿根植物，雌雄异株，具短根状茎[1]。其根状茎可供药用，具有活血化瘀[2]、祛风活络、祛痰止咳以及一定的抗癌功效[3]。牛尾菜分布较广，国内主要分布在北京、山东、河南、河北、吉林和黑龙江等地，主要生长于林下、平原、阴湿谷底。

牛尾菜种子属于典型的后熟类种子，果实成熟后，种胚处于球形胚阶段，这样的种子播种后当年不能萌发，需要2～3年才能少量发芽，生产和开发利用受到极大的限制[1]。本研究利用2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)联合变温结合赤霉素(GA3)和雪藏2种处理方法打破种子休眠，加快种子的萌发，探讨种胚发育过程中淀粉酶活性的变化规律，为牛尾菜种苗繁育和人工栽培奠定理论实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

牛尾菜种子采自吉林省集安市台上村。

β-极限糊精；10 mmol/L醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH值5.0)；0.1 mol/L NaAc缓冲液(含6 mol/L CaCl2、pH值 5.0)；DNS试剂；0.01% I2-KI溶液；2%可溶性淀粉；0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L不同浓度GA3。

1.2 试验方法

1.2.1 形态后熟处理 取种子用清水浸泡3～5 d后去除果皮、果肉、果穗以及漂浮在水面的种子，取水底的种子倒入4.50 mg/L 2，4-D、5.75 mg/L 6-BA混合溶液中，72 h后将种子捞出与湿沙以体积比 1 ∶3 搅拌均匀后装入透气性好的木槽中，覆盖塑料薄膜置于处理室中进行变温处理。变温幅度和时间分别为白天(23±2)℃，处理11 h，夜间温度为 (11±2)℃，处理时间为13 h。处理期限定为30～80 d，控制木槽内水分的相对湿度为70%，每隔5 d观察种胚形态。随机取100粒种子观察种子发芽数，重复3次取平均值。盾形胚发生率=盾形胚种子数量/供试种子总数×100%，子叶胚发生率=子叶胚的种子数量/供试种子总数×100%[4]。

1.2.2 淀粉酶活性测定

1.2.2.1 粗酶液制备 取不同发育阶段的牛尾菜种子各 2 g，按质量体积比1 ∶2加入0.1 mol/L NaAc缓冲液(含 6 mol/L CaCl2，pH值5.0)4 mL及少量石英砂研磨后过滤，滤液以20 000 r/min离心20 min，上清液以10 mmol/L NaAc缓冲液透析过夜，20 000 r/min离心10 min，上清液定容备用。

1.2.2.2α-淀粉酶活性测定 取0.1～0.5 mL粗酶液，加0.5 mLβ-极限糊精和10 mmol/L NaAc缓冲液定容至 1.0 mL，摇匀，30 ℃保温，隔5 min取0.1 mL反应液加0.01% I2-KI溶液5.0 mL和蒸馏水0.4 mL，摇匀后在 560 nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算β-极限糊精含量。

1.2.2.3β-淀粉酶活性测定 在具塞试管中加入2%淀粉5.0 mL，0.1 mol/L NaAc缓冲液(pH值5.0)1.0 mL和蒸馏水 3.9 mL，37 ℃预热5 min，加酶液0.1 mL，保温30 min后煮沸10 min，冷却后取0.5 mL样品、1.5 mL DNS试剂加入试管中，沸水浴中加热15 min，冷却后加10.0 mL蒸馏水，摇匀后在 540 nm 处测定吸光度。

1.2.3 生理后熟处理

1.2.3.1 GA3处理 变温处理后洗净种子，以0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L不同浓度梯度的GA3浸泡24 h。浸泡后的种子反复冲洗置于玻璃平皿中进行发芽处理。

1.2.3.2 雪藏处理 变温处理的方法同“1.2.3.1”节，到第2年1月末时挖1个土坑，将变温后的种子与湿沙按照体积比1 ∶3拌均匀之后装进袋子里放入坑中，用土盖好，到春天时将种子取出。

1.2.4 种子萌发 选择形状饱满优良的种子均匀地撒在铺有2层润湿滤纸的培养皿中，每个培养皿中放入等量种子，重复3组，将装有种子的培养皿放在恒温25 ℃避光条件下培养，培养过程中给予适量的水分，保证种子能充分润湿在滤纸上，每天换水保持种子湿润，并每天11：00记录发芽率。发芽率=种子发芽总数/供试的种子总数(100粒)×100%。

1.2.5 数据处理 利用多项式回归方程建立种胚不同发育阶段淀粉酶活性变化趋势线；利用多项式回归方程建立GA3浓度与牛尾菜种子发芽率之间的关系，通过相关指数检验回归显著程度；通过F检验检验数据的方差齐性；非参数检验(K-S)检测数据的正态性；利用双样本t检验雪藏处理与GA3处理之间发芽率的差异显著性；数据统计采用SPSS 19.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 牛尾菜种胚的发育

10月下旬采集的牛尾菜种子，属于典型的后熟品种，种子通常呈暗红褐色，直径4～5 mm，种子近球形，种胚为典型的球形胚(图1-A)，发生率98%。后熟处理30 d，胚内的生命活动活跃起来，在得到营养物质和能量后开始分裂和生长，种胚发育成盾形胚(图1-B)，发生率85%。后熟处理75 d，种胚发育成可萌发的子叶胚(图1-C)，发生率达79%，此时完成形态后熟。一定浓度GA3处理25 d或者雪藏处理至第2年开春均可打破生理后熟，子叶突破种皮，种子发芽(图1-D)。

2.2 牛尾菜种胚发育过程中α-淀粉酶、β-淀粉酶活性变化规律

未处理时，测得α-淀粉酶活性为(29.00±0.12)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性为 (7.24±0.32)U/mL；后熟处理30 d，α-淀粉酶活性为(31.98±0.56)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性为(9.28±0.15)U/mL；后熟处理75 d，α-淀粉酶活性为(33.96±0.69)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性为(10.02±0.58)U/mL。经500 mg/L GA3处理24 h后常规发芽25 d，测得最高发芽率为72%，α-淀粉酶活性为(32.97±1.02)mg/(g·5 min)，β-淀粉酶活性为(9.65±1.02)U/mL。由图2趋势线可知，在牛尾菜种胚发育过程中α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性逐渐升高，呈上升趋势，根据方程推算，发育至75 d，α-淀粉酶活性为33.995 mg/(g·5 min)达到顶峰；发育至67.92 d，β-淀粉酶活性为10.04 U/mL，达到顶峰。种子萌发出芽至发芽最高峰所得数据显示，之后α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性出现下降的趋势。

推测可能是牛尾菜种胚发育期间细胞分裂以及细胞生长须要消耗大量能量，淀粉酶活性的不断增加促进胚乳中的淀粉水解为单糖等物质，为细胞的生命活动提供可直接吸收的能量原料，当发育至可萌发的子叶胚时，完成形态后熟，此时α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性达到最高。当种胚突破种皮进入发芽阶段，α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性呈下降趋势，可以认为是胚乳中淀粉较多被利用而积累相对较少，且当种胚突破种皮萌发出芽后，种子即进入自养阶段，可依靠光合作用合成自身所需能源物质，故此时α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈下降趋势。

2.3 不同浓度GA3对牛尾菜种子萌发的影响

变温处理后未经GA3处理的牛尾菜种子不发芽，经0～800 mg/L不同浓度梯度GA3浸泡24 h处理后，在30 d达到萌发高峰，测得100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L浓度GA3浸泡的平均发芽率分别为15.30%、33.40%、45.57%、52.80%、71.87%、62.60%、58.23%、49.76%(图3)。

试验所得数据经SPSS 19.0分析处理得出回归方程y=-0.000 2x2+0.234 3x-3.537 8，r2=0.965 2，回归极显著(P<0.01)，说明GA3对牛尾菜种子萌发具有极显著影响。由趋势线可知，GA3浓度在大于15.25 mg/L时，随着浓度的升高，对牛尾菜种子发芽起促进作用，发芽率呈上升趋势。根据方程预测，GA3浓度为585.75 mg/L时，牛尾菜种子的发芽率最高，可达65.08%。GA3浓度高于最适浓度585.75 mg/L后，随着浓度的升高，牛尾菜种子发芽受到抑制，发芽率呈下降趋势(图3)。

2.3 2种处理方法对牛尾菜种子萌发的影响

非参数检验(K-S)检测结果表明，雪藏处理(P=0.98)与GA3处理(P=0.88)的发芽率数据可能来自正态总体；F检验结果显示，二者处理的发芽率具有方差齐性(P>0.05)。双样本等方差t检验结果表明，雪藏处理组和GA3处理组均可显著提高牛尾菜的萌发率，雪藏处理组较500 mg/L GA3处理组对种子的萌发效果更好(t=3.94，P=0.02)(表2)。经比较雪藏在提高种子萌发率方面表现出相对优势，但处理时间较长，需要大约3个月的生理后熟时间，500 mg/L GA3处理组相对萌发率略低，但只需要20～30 d即可完成生理后熟，可根据具体生产实践要求，选择最适的处理方法。

表2 2种方法对牛尾菜种子萌发率的影响

注：t-检验：平均值的双样本分析，P<0.05与对照组比较差异显著。

3 结论与讨论

成熟后的牛尾菜种子在满足萌发的自然条件下不能在短期内迅速萌发出芽，这是因为牛尾菜种子需要一定的条件和时间来完成形态后熟和生理后熟，该状况是由种子的种胚尚未发育完全或种子内存在生长抑制因素等导致的。牛尾菜种胚为球形胚，属于典型的后熟类种子，发育不完全，为单子叶植物，在促进种子萌发的过程中需要经过2个阶段，第1个阶段是形态后熟阶段，即从球形胚、盾形胚发育至可萌发的子叶胚，此过程在4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA浸泡 72 h 后变温处理下完成[5]；第2个阶段为生理后熟阶段，即通过一定浓度的GA3或者雪藏处理打破生理休眠。本研究采用2，4-D、6-BA联合变温处理，通过激素调控结合温度的变化，降低抑制种子萌发物质的活性，使种内促进萌发的物质得以激活，加快种胚的形态后熟，促进种子的萌发[6]，温度的变化幅度在2 ℃左右。

淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶等，它们广泛存在于动物、植物和微生物界，α-淀粉酶和β-淀粉酶是植物中最重要的2种淀粉酶。本研究通过对经后熟调控不同时期的牛尾菜种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的研究，探讨种胚发育过程中淀粉酶活性的变化规律，可以反映某一时期内牛尾菜体内代谢的变化，分析其种胚发育机制，能为研究牛尾菜种胚发育调控和育苗技术奠定理论基础。

GA3是植物生长发育过程中的一类重要的调节激素，在植物生长发育过程中能够解除种子休眠，促进种子萌发，同时抑制脱落酸的作用，在试验结果中可以确定GA3在牛尾菜种子打破休眠方面具有显著作用，但过高的浓度会抑制种子的萌发，使发芽率逐渐下降。雪藏处理是一个操作比较简单的处理方法，经雪藏处理后种子的发芽率可达(76.53±1.47)%。有研究证明，雪藏处理经历春天天气变暖，此时雪化为雪水，雪水对植物种子有一定的催芽作用，一方面雪水中含有的重水量少，比普通水少1/4，重水是一种放射性物质，对植物的生命有强烈的破坏和抑制作用；另一方面雪水中含有的氮化物比普通水高很多，主要是雪花结构较松散，具有较大的表面积，在雪花降落过程中能大量吸收空气中的游离氮等物质，这些氮化物与土壤中的一些酸性物质结合能形成有利于植物生长的氮肥，从而在种胚发育过程中起到一定的催芽作用[7]。经比较雪藏在提高种子萌发率方面表现出相对优势，但处理时间较长，需要大约3个月的生理后熟时间，此方法在北方比较常见，尤其是降雪较多的地方应该大力推广。500 mg/L GA3处理组相对萌发率略低，但只需要20～30 d 即可完成生理后熟，可根据具体生产实践要求，选择最适的处理方法。本研究克服了休眠长、发芽率低等因素对牛尾菜育种的影响，操作简单、成本低，能为牛尾菜人工栽培、生产和推广奠定基础。

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