普通白菜石蜡切片染色方法筛选及花芽分化形态学鉴定

宋红霞， 付 超， 侯雷平， 李梅兰

(山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapasubsp.chinensis)是典型的低温长日照二年生蔬菜，需要经过一段时间低温处理，通过春化，才可以在高温长日照条件下现蕾开花，而花芽分化是现蕾开花的前提，也是普通白菜从营养生长向生殖生长转变的形态标志[1]。详细的分化过程是开花调控机制研究的理论基础，同时对制定合理的栽培措施进行花期调控及实现分子遗传调控也有重要意义[2]。

石蜡切片技术是组织学和生物学研究的主要方法，传统石蜡切片的制作一般须经过脱水、透明、浸蜡、包埋、染色及封固等步骤[3]。在植物组织石蜡切片采用的染色方法中，染料的选择、操作方法和染色时间等都是影响染色成败的重要因素[4]。不少植物学研究者针对不同染色材料采用不同的染色方案和染色时间，探索了不同材料的最佳染色方法，如在粳稻颖果石蜡切片中对染色时间的摸索[5]，以及对韭菜、桦树松萝、水稻等染色方法的研究[6-8]。

关于普通白菜花芽分化的发生，李曙轩等已经进行过相关研究[9-10]，但对于石蜡制片方法没有进行报道而且分化过程不够详尽。因此，本试验以75#普通白菜为试验材料，对石蜡切片制作过程中不同染色方法、染色时间进行比较，并对花芽分化过程进行详细研究，以期为普通白菜的生殖发育研究提供理论支撑，也为白菜类蔬菜石蜡切片的染色方法提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

供试普通白菜75#为弱冬性自交系，由山西省农业科学院蔬菜研究所惠赠。

选取饱满且较为整齐一致的种子，用清水漂洗后于55 ℃水浸泡10 min，室温浸种2 h，然后置于铺有双层滤纸的培养皿中，置于25 ℃恒温光照人工气候室内催芽，光照时间 16 h/d。待胚根突破种皮后，将培养皿移至4 ℃冰箱，黑暗、低温处理20 d，其间保证种子萌发需要的水分[11]，处理结束后将幼苗种植于50孔穴盘中，内含泥炭-蛭石基质混合物(3 ∶1)，在温室进行常规栽培管理(白天最高温度30 ℃，夜间最低温度10 ℃，光照时间约11 h/d)。

1.2 方法

1.2.1 取样 待7张真叶展开后，每隔2 d剥取茎尖，在体视显微镜(Olympus SZX16)下观察发育时期，参照李曙轩等方法对不同花芽分化等级进行取样[9，12]。

1.2.2 固定包埋 参照Garcês等的方法[13-14]将样品进行包埋，之后放于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.3 切片 参照高行英的方法[15]，切片厚度为8 μm。

1.2.4 展片与粘片 以多聚赖氨酸(Sigma)为粘片剂，展片锅的温度为37 ℃恒温，将切下的蜡片放在液面上，光面朝下，蜡片展平后，将处理好的载玻片伸入水中，捞起蜡片，放在干净的工作台上，晾干。

1.2.5 脱蜡 为了将组织中的蜡去除，按照以下步骤进行操作：二甲苯10 min→1/2二甲苯+1/2纯乙醇10 min→纯乙醇5 min→95%乙醇10 min→85%乙醇10 min→70%乙醇5 min，逐级脱蜡。

1.2.6 染色方法及时间筛选 番红(AMRESCO)配方：1 g番红，100 mL 50%乙醇，过滤。固绿(AMRESCO)配方：0.5 g固绿，100 mL 95%乙醇。

番红染色步骤：番红液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→纯乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min。先设置3个较大的时间梯度：2、12、24 h，再在合适的时间内设置相对较小的时间梯度：0.5、1、2、4、6、8 h，以确定番红染色的最佳时间。

固绿染色步骤：固绿ys→纯乙醇30 s→纯乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min，染色时间：10、20、30 s。

番红-固绿对染：番红液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→固绿ys→纯乙醇30 s→纯乙醇1 min→二甲苯 3 min→二甲苯3 min，番红-固绿对染时间根据最佳时间进行搭配组合。

1.3 普通白菜花芽分化过程的观察

应用“1.2”节中得到的最佳染色方法将普通白菜的顶端部位进行组织切片，以观察主枝、侧枝花芽分化，分析其形态发生过程。

2 结果与分析

2.1 番红单独染色切片效果

根据图1的对比效果可以看出，染色12、24 h的组织较暗淡，而且染色24 h的组织清晰度不及染色2、12 h，染色2 h的组织清晰度最高，切片最为鲜亮，所以进一步设置小梯度时染色时间小于12 h。为了避免错过最好的染色时间，小于2 h也设置2个梯度，以考察小于2 h是否会有更佳的效果，因此小梯度染色时间设为0.5、1、2、4、6、8 h。

从图2可以看出，染色8 h时色彩暗淡，清晰度低；染色 6 h 组织的清晰度较好且均匀，但对比大量同时间段的切片染色效果可知，其染色稳定性差；染色4 h组织的清晰度较好但不均匀，其染色稳定性也差；染色2 h组织的清晰度高，均匀性好，其染色稳定性均比其他时间段要好；染色0.5、1 h时组织色彩较浅，清晰度不高，均匀性较差。本研究结果说明，番红最佳的染色时间为2 h。

2.2 固绿单独染色切片效果

观察不同固绿染色时间的染色效果(图3)得出，单独采用固绿对组织进行染色其清晰度均不高，不便于对花芽分化进程的观察。

2.3 番红-固绿对染切片染色效果分析

番红-固绿对染时番红采用的最佳染色时间为2 h，固绿设置10、20、30 s 3个染色时间梯度。比较几种方法可知，固绿染色10、20 s效果均不清晰；固绿染色30 s效果清晰，但2个固绿染色30 s的处理中30 s-1的颜色明显深于30 s-2(图4)。对比大量同时间段的切片染色效果，发现番红-固绿对染稳定性不高，说明番红-固绿对染不适合对普通白菜花芽分化进程的观察。

2.4 普通白菜花芽分化形态学鉴定

采用番红单染2 h制作石蜡切片，进行显微镜观察，将普通白菜花芽分化(叶原基经花原基到单花器官分化)分为图5中的8个阶段：0级(营养生长期)，生长点比较平坦，周缘有许多尖锥形的叶原基(图5-A)；1级(营养生长向生殖生长过渡期)，茎端生长点开始膨大，宽度、高度同时增加，其顶端逐渐变圆，隆起呈半圆状突起，生长点周缘仍不断分化叶原基，根据发育时间的长短，生长点隆起的高低稍有差异(图 5-B、C)；2级(花原基分化初期)，茎端生长点继续膨大伸长，具有1个中心圆突起，四周有2～3个小圆突起，即为花原基，这个阶段叶原基分化停止(图5-D)；3级(花原基分化盛期)，周围圆突起陆续增加，并不断发育增大伸长，可明显看到形成圆突群，花原基伸长长短依分化时间长短而异(图5-E、F)；4级(花柄伸长期)，花柄开始伸长，但不太长，萼片没有分化，圆突群分化为花蕾雏形(图5-G)；5级(花萼原基分化期)，花柄继续伸长，主茎第1花原基顶端周缘对称分化出新月形突起，即为花萼原基(图5-H)；6级(雌雄蕊原基分化期)，当花萼伸长将包围整个花原基时，在花芽中心生长锥基部，萼片腋间出现的对称突起为雄蕊原基，随着雄蕊原基的发育，花芽中心生长锥顶部凹陷，四周呈现环状突起，即雌蕊原基开始分化(图5-I、J)；7级(花瓣原基分化期)，在雌蕊原基分化的同时，萼片原基的内侧对称分化出箭头状突起，即为花瓣原基(图5-K)。至此，普通白菜已完成其主枝从叶原基经花原基到单花器官的分化，再经过大约2～3 d的时间，花蕾便肉眼可见。

普通白菜花芽分化从主枝生长点开始，生长点原基按照由外向内的次序依次进行，主枝先进行，一级侧枝次之。当主枝花柄伸长时，一级侧枝已经形成，但生长点较为平坦，还未开始花芽分化(图6-A)；当主枝萼片原基形成时，生长点隆起呈半球状，一级侧枝花芽进入分化期(图6-B)；当主枝达到雄、雌蕊原基分化期，最早长出的一级侧枝花芽进入萼片分化期(图6-C)，随后的分化过程同主花序；一级侧枝花芽分化的次序由顶部向基部依次进行(图6-D)。按照这样的规律，普通白菜完成单株花芽分化。

3 讨论

3.1 不同染色方法和时间的筛选

番红、固绿为植物组织学最常用的2种染料，番红的染色时间一般为2～24 h，固绿一般为10～60 s[16]。对于不同材料和染色试剂，染色时间应该根据试验材料、取样的时期和部位，在借鉴他人成熟方法的基础上进行探索。于晓刚等研究指出，粳稻花后不同时间的颖果最佳染色时间差异很大，发育前期的颖果幼嫩，固绿染色时间需要20～25 s，而后期的颖果染色时间只需要10～20 s[5]。王宁等指出，草莓采用番红-固绿对染的效果优于单独采用番红或固绿[17]。本试验结果表明，单独采用番红染色时，设置0.5～24 h染色，观察同时间段的切片染色效果，结果表明，2 h染色效果最均匀、稳定，且色彩鲜亮，便于观察；单独采用固绿染色时，普通白菜组织结构不够清晰，不便于观察；采用番红-固绿对染的稳定性均相对较差。因此，对75#普通白菜花芽的分化过程进行观察中采用番红单独染色2 h。

3.2 普通白菜花芽分化的形态学研究

在白菜的花芽分化研究中，李曙轩等对于白菜的分化过程仅观察到花原基分化结束，并将该过程分为6级，对于单花器官的发生没有进行报道[9]；王真真等未涉及不结球白菜花原基的发生盛期、侧枝花芽的发生过程，将花芽分化进程分为7级[10]。本试验对上述研究进行了详细补充，将普通白菜花芽分化过程分为8级，并完善了侧枝花芽的分化过程。本试验中花柄伸长时期就已经观察到侧枝花芽的发生，与李曙轩等的研究结果[9]一致，但早于王真真等的研究结果[10]，因此关于普通白菜侧枝花芽的发生时期还有待进一步研究。本试验观察到侧枝花芽的发生顺序为由顶部向基部依次分化，与惠麦侠等对于大白菜的研究结果[18]一致，但与陈机的研究结果[19]不一致，可见对于白菜类蔬菜侧枝花芽分化的顺序还有待进一步研究。

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