沙地云杉、沙冬青和山杏ISSR-PCR反应体系优化及种间多态性比较

郑舒文， 洪晓松， 王 昊

(辽宁省盐碱地利用研究所，辽宁盘锦 124000)

沙冬青、山杏和沙地云杉都是内蒙古地区的特有植物。沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]属于豆科蝶形花亚科沙冬青属，是古老的残遗濒危物种，为常绿灌木，主要分布在我国西北地区，是中国北方干旱半荒漠地区唯一的旱生常绿阔叶灌木[1-2]，具有水土保持、固沙、观赏和药用价值[3]。沙地云杉(Piceamongolica)是中国稀有珍贵树种，集中成片分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的白音敖包自然保护区，具有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点[4]。山杏(SiberianApricot)又名西伯利亚杏，为蔷薇科杏属植物，主要分布在俄罗斯的西伯利亚、蒙古的东部和东南部以及我国北纬40°地区，抗低温能力强，根系发达，抗旱、耐瘠薄、耐盐碱，不耐涝。

内蒙古属典型的中温带季风气候，具有降水量少而不匀、寒暑变化剧烈的显著特点[5]。这些生存并且繁衍的植物为了适应恶劣的环境，生理性状发生改变的同时遗传因子肯定也会发生一系列的变化。因此本研究通过4种特有物种的遗传多样性的分析，为种间杂交育种提供理论基础，实现内蒙古特有植物的繁衍，进而为美化内蒙古的环境作出贡献。

1 材料与方法

1.1 试验材料

摘取沙冬青、山杏、沙地云杉的种子，分装放在布袋里，放在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 取各自的种子，去掉种皮，利用CTAB法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测纯度和浓度，UVP型凝胶成像分析系统拍照记录，最后分别装入1.5 mL离心管并保存在-20 ℃的条件下。

1.2.2 PCR扩增 ISSR-PCR反应体系经过优化确定为 20 μL，其中引物1 μL、TaqMix 10 μL、水8 μL、50 ng的模板 1 μL。引物序列由加拿大哥伦比亚大学提供，在上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃ 变性 45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；最后72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。配制1.2%的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE的缓冲液中电泳45 min左右，取出凝胶，在UVP凝胶成像系统中拍照保存。

1.2.3 数据处理 记录电泳图谱中明亮清晰谱带，建立“0-1”二元数据矩阵，在同一位置上，有谱带的记作 “1”，没有谱带的记作“0”。利用POPGEN32软件，得出观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样度(He)和Shannon多态性信息指数(I)。通过NTsys2.10e软件，计算各供试材料间的相似性系数，采用UPGMA方法进行聚类分析，获得聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 4种植物DNA的检测

基因组DNA质量的好坏是后续试验的保证。本试验直接用种子和改良的CTAB法提取4种植物的基因组DNA，如图1可直接观察到所提取的DNA条带清晰明亮，并基本在同一水平位置上。说明基因组DNA完整性好，没有降解现象。DNA模板的质量已经满足试验要求，可用于下一步的ISSR-PCR反应。

2.2 引物筛选和ISSR扩增分析

利用优化的反应体系从100个ISSR引物中筛选出11个稳定性好的引物进行分析，如表1所示，11个引物对沙冬青、沙地云杉、克旗山杏、凉城山杏这4种植物共扩增出187条谱带，其中多态性DNA谱带184，多态性条带比例的平均值是98.40%。扩增条带大多在500～2 000 bp之间。每个引物扩增出7～12条不等的条带，扩增条带数的平均值为9.5条，多态性条带的均值为9，多态性百分率高达99.9%。从图1和图2都可以看出，同一个引物下，4种植物扩增出的谱带不同，但是可以从谱带的位置清晰地看出4种植物遗传多样性的差异很显著。

表1 11条ISSR引物序列及其PCR扩增

2.3 4种植物的遗传多样性分析

观测等位基因(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多样度(He)与Shannon’s 信息指数(I)是度量遗传多样性水平的常用指标，运用 POPGENE32对4个种进行分析。4种植物在DNA水平上的PPL达到98.40%(表1)，由于它们是不同物种，所以多态性条带较多是正常现象。4种植物的观测等位基因数为1.984 0，有效等位基因数为1.678 1。其中有效等位基因数的数值越接近所检测到的观测等位基因数的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀，因为有效等位基因数是反映群体遗传变异大小的一个指标[14]。分析结果表明，它们相差0.305 9，差值相对较小，等位基因在群体中分布均匀，表明4种植物除了2个山杏物种遗传多样性相近以外，4种植物可能因为生长的环境相似，遗传多样性也有相对于其他植物没有的共通点。另外，4种植物的基因多样性指标He(0.396 4)和I(0.582 0)的值相对较小，遗传多样性相对较近，进一步说明它们之间的相似性。

2.4 遗传距离和相似性的聚类分析

通过PopGen32计算Nei’s遗传距离，分析4种植物的遗传关系，4种植物的遗传距离分布在0.401 1～0.913 6之间(表2)。其中沙冬青与凉城山杏遗传距离为0.913 6，距离最大；克旗山杏和凉城山杏的遗传距离是0.486 2，距离最小。遗传距离是评价种间遗传变异水平的重要指标，遗传距离越小，亲缘关系越近；遗传距离越大，亲缘关系越远。由于克旗山杏和凉城山杏这2个植物是相同属种，亲缘性相关遗传距离相对较近。但是克旗山杏和沙地云杉的遗传距离为 0.653 8，相对其他2个植物的遗传距离而言较小，说明它们之间存在一定的相似性。利用UPGMA法构建的聚类图见图4。由图4可知，在0.64的区分度下，克旗山杏和凉城山杏聚为一类，沙冬青和沙地云杉各自一类。在0.45的区分度下，沙地云杉和山杏聚为一类。在0.43的区分度下，沙冬青跟山杏和沙地云杉聚成一类。表明沙地云杉与山杏有一定的相似性，4种植物的遗传一致度、遗传距离和聚类分析结果一致。

表2 物种种间遗传一致度和遗传距离

注：上三角为遗传一致度，下三角为遗传距离；1～4分别是沙冬青、克旗山杏、凉城山杏、沙地云杉。

3 结论与讨论

采用分子标记探讨植物的相似性已有较多的报道[6-8]。 目前，分子标记已广泛应用于植物物种鉴定、指纹图谱、遗传多样性、基因定位及分子生态学研究。本研究从100个ISSR引物中筛选出11个扩增条带清晰且多态性高的引物，采用这11个引物对沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和凉城山杏进行遗传多样性研究。应用POPGENE32分析和UPGAM法聚类分析，结果表明：沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和凉城山杏可分为3类，首先克旗山杏和凉城山杏为Ⅰ类，沙地云杉为Ⅱ类，沙冬青为Ⅲ类。通过聚类分析结果显示，除了山杏物种之间的亲缘性之外，沙冬青与它们的遗传距离大，相似性较低；沙地云杉与山杏2个不同物种却有一定的相似性，遗传距离小。

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