超声波辅助酸法制备红薯抗性淀粉及其结构表征

杨小玲 赵 维 陈佑宁 孟小华

(咸阳师范学院化学与化工学院，咸阳 712000)

抗性淀粉(Resistant Starch，RS)又称抗酶解淀粉、抗消化淀粉，由英国生理学家Englyst提出[1]。抗性淀粉是一种新型低热量功能性食品基料，其生理功能类似膳食纤维，具有降低胆固醇浓度，调节血糖，改善胰岛素的敏感性，影响脂质代谢，改善肠道菌群以及预防结肠癌和防止糖尿病，促进维生素和矿物质离子的吸收等作用，在国内外受到广泛关注[2-4]。

根据淀粉来源和抗酶解性，将抗性淀粉分为五类[5]，其中第三类抗性淀粉RS3，即回生淀粉，是指糊化后淀粉在凝沉过程中部分分子重新聚集成新的结晶体而难以被酶消化，主要存在于冷食物、油炸土豆片和面包等食品。因其抗酶解性最强，对热稳定性好且产品安全性高，应用前景广阔。RS3的制备方法主要有：压热处理法、螺杆挤压法、微波辐射法、支链淀粉悬浮液脱支法、蒸汽加热法等。超声技术应用于淀粉领域，具有作用时间短、降解非随机性、操作简单易控制及能耗较低等优点，是淀粉改性的一种新型物理方法。

本研究采用的是超声波辅助酸解法制备RS3(以下简称RS)。主要研究了超声作用时间、酸的种类和浓度、淀粉乳浓度、酸解时间对RS含量的影响效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红薯淀粉(食品级)：市售；葡萄糖(分析纯)：天津市津北精细化工有限公司；胃蛋白酶：美国Ark公司；耐高温α-淀粉酶：上海金穗生物科技有限公司；糖化酶：华迈科生物技术有限责任公司。

JSM-6460型扫描电镜：日本电子JEOL社；Q100型差示扫描量热仪：美国TA公司；Mini Flex 600型X射线粉末衍射仪：日本理学株式会社；KQ-5200DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗性淀粉的制备

空白实验及超声条件的确定：称取红薯原淀粉5等份，分别加入到淀粉质量分数为15%的5份悬浮液中，在工作频率40 kHz，超声功率200 W，温度40 ℃的恒温水浴条件下超声处理一定时间，然后升温至95 ℃糊化30 min，自然冷却后，在5 ℃下冷藏24 h，干燥。

酸的种类和浓度、淀粉浓度、冷藏时间的确定：称取红薯原淀粉若干等份，分别加入到不同浓度各种溶液种配成一定淀粉质量分数的悬浮液，在工作频率为40 kHz，超声功率为200 W，温度为40 ℃的恒温水浴条件下超声处理一定时间，自然冷却后，置于25 ℃的恒温振荡器中振荡一定时间，再用0.25 mol/L的NaOH中和，然后升温至95 ℃糊化30 min，自然冷却后，在5 ℃下冷藏24 h，干燥。

1.2.2 Goni-DNS法测定抗性淀粉含量[6]

称取2.1制备的样品100 mg，加入10 mL的KCl-HCl pH为1.5的缓冲液和胃蛋白酶溶液(1 g胃蛋白酶溶于10 mL的pH 1.5的KCl-HCl缓冲液)0.2 mL，在38 ℃的恒温60 min，自然冷却至室温，调节pH为6.0～6.4，加入7.5 mg的α-耐高温淀粉酶，在95 ℃下振荡30 min，冷却至室温，调pH值至4.5，向其中加入5 mg的糖化酶于60 ℃恒温振荡1 h,冷却至室温后，以3 000 r/min离心15 min，倒掉上清液，沉淀用80%的乙醇和蒸馏水分别清洗1次，在沉淀中加入4 mol/L的KOH 2 mL溶解沉淀，以浓度为37%的HCl调节pH至4.5，加入5 mg的葡糖淀粉酶在60 ℃下恒温振荡30 min，以3 000 r/min离心10 min，将上清液倒入容量瓶，水洗沉淀重复3次，合并上清液，用蒸馏水定容至100 mL，待用。

还原糖的含量计算，使用DNS法。取1 mL的上清液于25 mL的具塞试管中，向其中加入1 mL蒸馏水，2 mL DNS试剂，分别使其混合均匀，煮沸5 min，取出后用流水迅速冷却，再用蒸馏水将其定容至25 mL，分别测定各溶液的吸光度，利用标准曲线计算出还原糖含量，根据公式计算抗性淀粉含量。

抗性淀粉含量=还原糖含量×0.9×100%

1.2.3 抗性淀粉的提纯

称取2.1制备的样品10 g，加入KCl-HCl缓冲液1 L和胃蛋白酶溶液20 mL，38 ℃水浴保温1 h，待其冷却至室温，用磷酸盐缓冲液调节pH至6.8，加入耐高温的α-淀粉酶0.75 g，95 ℃恒温振荡30 min，冷却至室温后，用醋酸钠缓冲液调节pH到4.5左右，加入糖化酶0.5 g，在60 ℃下振荡60 min，冷却到室温后，在3 500 r/min条件下离心20 min，弃上清液，用无水乙醇洗沉淀3次，收集沉淀，冷冻干燥。

1.2.4 结构表征及性质测定

1.2.4.1 DSC热分析

称取淀粉样品1～3 mg于铝坩埚中，在氮气保护下，10 ℃/min的升温速率，40～300 ℃的温度范围内进行扫描。记录样品的DSC图谱。

1.2.4.2 扫描电镜

测定条件为：工作电压20 kV；加速电流15 mA，观察并拍摄淀粉颗粒形貌。

1.2.4.3 X射线衍射测试

操作条件：Cu Kα辐射，扫描电压40 kV，电流40 mA，扫描速度:8°/min，采样宽度0.02°，扫描角度范围为10°～60°。

2 结果与讨论

2.1 淀粉的超声处理及产物干燥方式的选择

超声波辅助淀粉酸解有两方面作用[7]，一是经超声作用导致淀粉分子发生降解，淀粉链断裂，直链淀粉含量增加，聚合度降低；二是超声作用破坏了淀粉的颗粒表面及结晶结构，淀粉化学反应活性增加[8-9]，据文献报道，聚合度在100～610之间时，抗性淀粉含量随淀粉链长增加而增大[10-11]。因此，超声时间长短决定了淀粉聚合度大小，而聚合度大小又影响直链淀粉分子重排能力及RS含量。从表1可见，经超声处理的RS含量均较未超声的RS含量(4.531%)提高，而且随着超声时间延长，RS含量先增大后减小。因此，选定超声15 min预处理淀粉乳。

表1 超声波处理时间对RS含量的影响

采用两种干燥方式：一种是在40～50 ℃烘箱烘干，干燥后的产品表面发黄易结块；另一种是在-60～-65 ℃低温下冷冻干燥，干燥后的产品为分散性良好的白色粉末(未提纯的抗性淀粉)和白色片状(提纯的抗性淀粉)。因此，实验采用冷冻干燥法处理产物。

2.2 酸的种类及浓度对抗性淀粉含量的影响

固定超声时间15 min，淀粉乳浓度15%，酸解时间8 h，改变酸的种类及浓度，RS含量结果见表2。

表2 不同种类及浓度的酸对RS含量的影响

由表2可看出，RS含量均随着酸的浓度的增大先升高后降低，以质量分数为1%的丙酸酸解的RS质量分数最高，为20.27%，其次是1.5%丙酸酸解的RS质量分数18.268%，再次是1%的乳酸酸解的RS质量分数16.403%，而0.5%的盐酸酸解的RS质量分数最低，为6.886%。袁腊梅[12]进行酸水解法制备抗性淀粉，结果表明酸水解能有效提高大薯抗性淀粉的产率，且影响效果为柠檬酸>盐酸>醋酸。吴亨[13]探讨了抗性淀粉的制备工艺，发现在盐酸、柠檬酸体系中制备抗性淀粉的效果优于醋酸体系，表明酸的种类和酸解体系中的pH值均影响抗性淀粉的生成。可见，RS含量与酸的种类及浓度都有关。

2.3 淀粉乳质量浓度的选择

固定超声时间15 min，1%丙酸溶液，酸解时间8 h，改变淀粉乳浓度，其RS含量见表3。

表3 淀粉乳浓度对RS含量的影响

从表3可见，在其他条件相同的情况下，随着淀粉质量浓度从5%增大至25%，RS含量呈现先升高后降低的趋势，且当淀粉质量浓度为20%时，RS含量最高。说明淀粉乳浓度过高或过低都不利于抗性淀粉的形成。当淀粉乳浓度较低时，产生的直链淀粉分子碰撞几率低，因而不利于抗性淀粉的生成，RS含量低；当淀粉乳浓度较高时，淀粉颗粒难以充分膨胀、糊化，糊液黏度、流动性差，不利于直链淀粉分子相互接近，形成双螺旋和结晶，亦不利于抗性淀粉形成，因而RS含量下降。

2.4 酸解时间对抗性淀粉含量的影响

固定超声时间15 min，淀粉乳质量浓度20%，以1%的丙酸溶液酸解淀粉乳，所制备的RS含量结果见表4。

表4 酸解时间对RS含量的影响

从表4可见，在其他条件不变的情况下，随着酸解时间的延长，RS含量呈现先增后减趋势。当酸解4 h时，RS含量达到最大值。酸解时间太短，淀粉长链分子没有充分降解，直链淀粉分子没有完全游离出来，因而RS含量低；酸解时间太长，淀粉分子过度降解，造成直链淀粉分子聚合度太小，亦不利于抗性淀粉形成，RS含量降低。

2.5 结构表征

由图1可见，处理前后淀粉颗粒形貌发生很大变化，红薯原淀粉为表面光滑的多面体颗粒状，粒径小；形成抗性淀粉后，颗粒状消失，变为粒径大幅增加的表面布满褶皱的片状。这是因为红薯淀粉经超声、酸解、糊化、冷藏一系列处理后，结晶结构发生很大变化，在抗性淀粉的形成过程中，自由卷曲的直链淀粉分子相互靠近，通过分子间氢键形成双螺旋，许多双螺旋相互叠加形成许多微小的晶核，晶核不断生长、成熟，成为更大的直链淀粉结晶。

图1 红薯原淀粉及抗性淀粉的扫描电镜图(×1 000)

由图2可以看出，与原淀粉相比，超声酸解处理后得到的抗性淀粉样品的热学特性有较大差异。红薯原淀粉在86.6 ℃有一个宽而强的峰，为水分蒸发及支链淀粉熔融产生的吸收峰；抗性淀粉在96.7 ℃出现了一个宽而强的吸收峰。这是由于超声酸解处理后，抗性淀粉的结构比原淀粉的结构整齐且紧密，相变温度升高，也说明淀粉的热稳定性升高了。另外，抗性淀粉在147 ℃还出现了一个强而尖锐的晶体相变吸热峰，说明了抗性淀粉主要是由直链淀粉通过氢键形成致密的双螺旋结构，因此破坏这种结构需要更多的热量的结果。与文献报道相吻合[14-15]。

图2 红薯原淀粉及RS的DSC曲线

图3 红薯原淀粉及RS的XRD图谱

从图3可以看出，红薯原淀粉在15.2°、17.1°、18.1°、23.1°处出现较强衍射峰，晶型为A型；得到的抗性淀粉在17.2°、22.2°、24.1°处出现较强衍射峰，说明超声酸解法处理后的淀粉的结晶结构发生转变，RS晶型为B型。

3 结论

以红薯淀粉为原料，采用超声波辅助酸解法制备RS，确定了制备抗性淀粉的工艺条件为：以质量分数为1%的丙酸溶液酸解质量分数为20%的淀粉乳，依次经过超声处理15 min，恒温振荡4 h，冷藏24 h，冷冻干燥，其抗性淀粉的含量为24.827%。由扫描电镜、差示扫描量热分析及X-射线衍射分析结果表明，经超声酸解处理后，淀粉的结晶结构和表面形貌均发生转变，其粒径明显增大，形貌由原来表面光滑的多面体颗粒状变为表面有褶皱的片状结构，晶型由A型转变为B型。

[1]ENGLYST H N,TROWEL H,SOUTHGATE D，et al.Dietary fiber and resistant starch[J].The American Journal of Clinical Nutrition,1987(46):873-874

[2]WANG Jing,JIN Zhengyu,YUAN Xiaoping.Preparation of resistant starch from starch-guar gum extrudates and their properties[J].Food Chemistry,2007,101(1):20-25

[3]谢涛,张淑远,王美桂.马铃薯抗性淀粉消化前后的益生作用与结构变化[J].食品科学,2014,35(15):105-108

XIE Tao,ZHANG Shuyuan,WANG Meigui.Probiotic functions and structural changes of potato resistant starch before and after digestion[J].Food Science,2014,35(15):105-108

[4]FUENTES-ZARAGOZA E,RIQUELME-NAVARRETE M J,SNCHEZ-ZAPATA E,et al.Resistant starch as functional ingredient:A review[J].Food Research International,2010,43(4):931-942.

[5]方长云,胡贤巧,卢林,等.稻米抗性淀粉的研究进展[J].核农学报,2015,29(3):0513-0520

FANG Changyun,HU Xianqiao,LU Lin,et al.Advances in study on rice resistant starch[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2015,29(3):0513-0520

[6]薛慧,张国治,吕飞杰,等.抗性淀粉测定方法的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2012,33(4):57-60

XUE Hui,ZHANG Guozhi,LYU Feijie,et al.Study on Resistant Starch Determination Methods[J].Journal of Henan University of Technology (Natural Science Edition ),2012,33(4):57-60

[7]赵奕玲，廖丹葵，张友全，等.超声波对木薯淀粉性质及结构的影响[J].过程工程学报,2007,7(6):1138-1143

ZHAO Yiling,LIAO Dankui,ZHANG Youquan,et al.Effects of ultrasonic wave on the properties and structure of cassava starch[J].The Chinese Journal of Process Engineering,2007,7(6):1138-1143

[8]王振斌,赵帅,邵淑萍,等.超声波辅助淀粉双酶水解技术及其机理[J].中国粮油学报,2014,29(5):42-47,57

WANG Zhenbin,ZHAO Shuai,SHAO Shuping,et al.Effect of ultrasound treatment on the double-enzyme hydrolysis of starch and its mechanism[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2014,29(5):42-47,57

[9]黄祖强,陈渊，钱维金,等.机械活化对玉米淀粉结晶结构与化学反应活性的影响[J].化工学报,2007,58(5):1307-1313

HUANG Zuqiang,CHEN Yuan,QIAN Weijin,et al.Mechanical activation effects on crystal structure and chemical reaction activity of maize starch[J].Journal of Chemical Industry and Engineering,2007,58(5):1307-1313

[10]赵奕玲.超声处理对淀粉性能的影响及磷酸酯淀粉的制备与应用研究[D].南宁:广西大学,2007

ZHAO Yiling.Study on effects of ultrasonic treatment on starch properties and preparation of starch phosphate and its application[D].Nanning:Guangxi University,2007

[11]吕思伊.米发糕的老化机理和抗老化研究[D].武汉:华中农业大学,2010

LÜ Siyi.Study on staling mechanism and anti-staling of fermented rice cake[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2010

[12]袁腊梅.大薯抗性淀粉制备工艺及特件研究[D].海口:海南大学,2012

YUAN Lamei.Research of preparation and characteristics of resistant starch from dioscorea alata linn[D].Haikou:Hainan University,2012

[13]吴亨.抗性淀粉的制备工艺比较及其形成影响因素研究[D].南宁:广西大学,2014

WU Heng.Research on the different preparation methods of resistant starch and its influential factors of formation[D].Nanning:Guangxi University,2014

[14]余焕玲,曾凯宏,杨参,等.抗性淀粉研究方法[J].粮食与油脂,2001,9:32-33

YU Huanling,ZENG Kaihong,YANG Shen,et al.Method of study for resistant starch[J].Cereals & Oils

[15]冷志富.玉米抗性淀粉的制备及其理化性质研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2014

LENG Zhifu.Preparation of corn resistant starch and research of its physicochemical properties[D].Yangling:Northwest Agriculture and Forestry University,2014