反相高效液相色谱法同时测定茶碱和多索茶碱的血药浓度

赵瑞柯+曹俊华

[摘要]目的 建立反相高效液相色谱法同时测定血浆中茶碱和多索茶碱的浓度。方法 色谱柱为Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水（30∶70）；流速为1 ml/min；检测波长为273 nm，内标为咖啡因。结果 茶碱和多索茶碱在1.05～67.33 μg/ml的浓度范围内线性关系良好（r>0.999）；茶碱和多索茶碱的方法回收率分别为96.79%～105.40%、91.85%～95.51%， 日内、日间相对标准偏差（RSD）均<10%。结论 本方法简单、准确，适用于同时测定茶碱和多索茶碱的血药浓度。

[关键词]茶碱；多索茶碱；血药浓度监测；反相高效液相色谱法

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（c）-0007-03

Simultaneous determination of the concentration of Theophylline and Doxofylline in human plasma by revered-phase high performance liquid chromatography

ZHAO Rui-ke1 CAO Jun-hua2

1.Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medcine Hospital of Changsha City in Hu′nan Province，Changsha 410100，China；2.Department of Pharmacy in Mawangdui Area，People′s Hospital in Hu′nan Province，Changsha 410000，China

[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of theophylline and doxofylline in human plasma by RP-HPLC.Methods Phenomenex C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm） column was used.The mobile phase was composed of methanol-water （30∶70） at flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 273 nm and the internal standard was caffeine.Results The linear range was 1.05 to 67.33 μg/ml for theophylline and doxofylline （r>0.999）.The recovery rates was 96.79%-105.40% and 91.85%-95.51% respectively.The intra-day precisions and the inter-day precisions were both less than 10%.Conclusion The method is rapid and accurate.It can be used for the simultaneous determination of theophylline and doxofylline concentration in human plasma.

[Key words]Theophylline；Doxofylline；Plasma concentration monitoring；RP-HPLC

茶堿是临床上治疗支气管哮喘的经典药物，其通过抑制磷酸二酯酶，使细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量增高而发挥药理作用。茶碱的有效血药浓度与中毒浓度非常接近，因此临床应用需要监测其血药浓度[1]。多索茶碱是新型的甲基黄嘌呤衍生物，其支气管平滑肌松弛作用是茶碱的10～15倍，并有镇咳作用。多索茶碱的毒副作用较茶碱少，但是大剂量仍可引起血压下降等不良反应[2-3]。目前茶碱和多索茶碱的血药浓度测定多有报道，但是同时测定的文献较少。茶碱和多索茶碱互为补充，临床上存在着两者交替使用甚至合并使用的情况[4-6]。本研究建立了反相高效液相色谱法同时测定血浆中茶碱和多索茶碱的药物浓度，现报道如下。

1仪器与材料

1.1仪器

LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，Shimadzu CLASS-VP液相工作站（日本岛津）；梅特勒-托利多AG285电子分析天平（瑞士，精度：0.01 mg）；TG16-W 微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；WH-2 微量旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

1.2药品与试剂

氨茶碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100336-200703，含量为99.9%），多索茶碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100109-200305，含量为99.9%），咖啡因对照品（内标，中国药品生物制品检定所，批号：100757-200556，含量99.1% ）， 甲醇（色谱纯，Merck，Germany），水为双重蒸馏水，其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），预柱：Phenomenex C18柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40℃；流动相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1 ml/min；检测波长：273 nm；进样量：10 μl。endprint

2.2标准溶液的制备

精密称取氨茶碱对照品10.1 mg 、多索茶碱对照品10.1 mg，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成10.10 μg/ml的对照品储备液；另精密称取咖啡因对照品10 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得浓度为100 μg/ml的内标溶液。以上样品均置于4℃的冰箱保存备用。

2.3血浆样品的处理

取血浆0.35 ml，置于1.5 ml的EP管中，加入内标溶液25 μl，再加入甲醇溶液1.1 ml，涡旋振荡1 min，以10 000 r/min离心10 min，取上清液10 μl进样。

2.4色谱行为

空白血样、空白血样中加入对照品和内标血样经HPLC分析得到色谱图（图1）。茶碱、多索茶碱和内标的保留时间分别为7.1、13.8、9.6 min，基线平稳，峰形良好，无杂质峰干扰。提示本方法具有较高特异性，能够准确测定血浆中茶碱和多索茶碱的浓度。

2.5线性范围与最低检测限

用空白血浆将茶碱对照品和多索茶碱对照品溶液稀释成不同浓度（1.05，2.11，4.21，8.42，16.83， 33.66，67.33 μg/ml）的含药血浆，按“2.3”项下处理方法处理并测定，以茶碱、多索茶碱的峰面积和内标的峰面积比值与茶碱和多索茶碱的浓度进行线性回归，分别得到回归方程为Y=18.591X-0.457（r2=0.9987）、 Y=17.362X-0.256（r2=0.9963），结果提示茶碱和多索茶碱在1.05～67.33 μg/ml范围内线性关系良好，最低定量限为1.05 μg/ml。

2.6回收率与精密度试验

分别配制浓度为2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱的血浆样品标准管，按 “2.3”项下操作，测定峰面积，按回归方程计算实测浓度，分别在同一天内测定5次和每天5次连续测定3 d，分别考察方法的日内、日间精密度和回收率。

配置浓度为2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱标准液各5份，直接进样得峰面积。用空白血浆配置不同浓度的茶碱、多索茶碱标准血浆各5份，平行操作，进样得峰面积。将萃取前后的峰面积进行比较，计算方法的提取回收率（表1）。

2.7样品稳定性考察

血浆样品室温放置稳定性：用空白血浆配制相当于浓度2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱的血浆样品，考察其在-20℃冷冻保存、反复冻融、室温条件下的稳定性。结果提示，茶碱和多索茶碱的血浆样品在-20℃保存20 d，反复冻融3次，室温条件下放置10 h，测得的浓度与理论浓度相比，RSD均<10%，提示茶碱和多索茶碱在上述条件下保持稳定（表2）。

2.8临床应用

患者，男，73岁，诊断：慢性阻塞性肺疾病急性加重，高血压3级（极高危）。入院后医嘱给予患者氨茶碱注射液0.25 g和0.9%氯化钠注射液250 ml静脉滴注，12 h给药1次。第4天测定茶碱谷浓度为17.3 μg/ml，患者已有较明显的恶心呕吐等中毒症状。医生调整遗嘱，改为多索茶碱0.2 g和0.9%氯化钠注射液250 ml静脉滴注，12 h给药1次，第8天给药前测定多索茶碱谷的浓度为8.46 μg/ml ，患者哮喘控制佳，且無不良反应发生。

3讨论

目前国内外报道的茶碱和多索茶碱HPLC同时测定的方法主要有固相提取法[7]、液液萃取法[8]、直接蛋白沉淀法[9-15]等。固相提取法操作过程繁琐，液液萃取法通常采用的氯仿、异丙醇等易挥发试剂，对身体有较大毒性，且过程需要萃取、转移、挥干等，操作一致性和稳定性较差。而已有的蛋白沉淀法，多采用10%三氯醋酸、10%高氯酸等，上清液需用微孔滤膜过滤，流动相中加入三乙胺等改善拖尾。本法沉淀剂选用甲醇，流动相采用甲醇-水，对色谱柱损伤较小。

多索茶碱与茶碱在化学结构上的区别是多索茶碱在茶碱的7位上加了1个二氧戊环，这是两者在色谱柱上能够分离的基础，多索茶碱的保留时间比茶碱延长了许多。流动相中有机相与水相的比例对茶碱和多索茶碱的保留时间有很大的影响，本研究考察了甲醇与水的不同配比，当甲醇比例>35%时，茶碱色谱峰和血浆内源性杂质峰无法分离。当甲醇∶水的比例为3∶7时，茶碱、多索茶碱、内标与杂质峰分离效果较好，出峰时间适宜，满足了测定需求。

以往认为茶碱的有效治疗浓度范围是10～20 μg/ml，近些年研究发现茶碱在低浓度（5～10 μg/ml）时有显著的抗炎作用及免疫调节作用，故把茶碱的有效血药浓度定为6～15 μg/ml更合理，该浓度兼顾了茶碱的扩张支气管和抗炎作用，又减少了毒性作用的发生[16-18]。多索茶碱的有效药物浓度仍无统一标准，但考虑到多索茶碱的药理作用是茶碱的10～15倍，在<5 μg/ml时是否有临床意义还需进一步研究。本方法的测定范围（1.05～67.33 μg/ml）完全覆盖了最低有效浓度和中毒浓度，可以满足临床测定的需要。

目前在临床治疗上，为了控制哮喘的急性症状，口服多索茶碱的患者仍可能静脉注射茶碱注射液，使用本方法可同时快速准确地测定茶碱和多索茶碱的血药浓度，为临床及时调整剂量、减少不良反应的发生提供依据。

[参考文献]

[1]香松林，高奇，寿志南，等.慢性阻塞性肺疾病急性加重期不同剂量氨茶碱疗效、不良反应观察[J].中国医院药学杂志，2017，37（6）：526-529.

[2]Sankar J，Lodha R，Kabra SK.Doxofylline：the next generation methylxanthine[J].Indian J Pediatr，2008，75（3）：251-254.endprint

[3]Shukla D，Chakraborty S，Singh S，et al.Doxofylline：a promising methylxanthine derivative for the treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].Expert Opin Pharmacother，2009，10（14）：2343-2356.

[4]王瑞华，鞠浩爽，黄庆华，等.高效液相色谱法同时测定人血清中茶碱、二羟丙茶碱、多索茶碱的浓度[J].中国医院药学杂志，2015，35（21）：1921-1925.

[5]陈崛耸，王海静，罗远强，等.氨茶碱联合多索茶碱治疗哮喘临床疗效观察[J].中国实用医药，2015，10（12）：169-170.

[6]刘越童，马和平，李汉军.慢性阻塞性肺疾病患者应用氨茶碱联合多索茶碱治疗的临床疗效观察[J].中国医学前沿杂志，2014，6（7）：42-44.

[7]郭均平，万洪波，冯印杰，等.固相萃取结合高效液相色谱法测定人血浆中多索茶碱浓度[J].中国药师，2005，8（4）：296-297.

[8]张莉，张明香，徐兵，等.高效液相色谱法同时测定患者血清中茶碱和多索茶碱的浓度[J].中国医院药学杂志，2009， 29（22）：1964-1965.

[9]马金秋， 王娜， 王莉，等.RP- HPLC法测定人血清中茶碱与多索茶碱的浓度[J].中国药房，2010，21（18）：1665-1667.

[10]毕津莲，付成效，李湘斌，等.反相高效液相色谱法同时测定人血清中茶碱和多索茶碱的浓度[J].中国现代医学杂志，2011，21（5）：652-658.

[11]朱金平，林秀丽，陈春枚，等.互為内标法测定人血清中茶碱与多索茶碱的浓度[J].海峡药学，2011，23（6）：243-245.

[12]唐富山，佟婉红，牟希恒，等.反相高效液相色谱法同时测定血清中多索茶碱和茶碱的浓度[J].甘肃医药，2011， 30（9）：517-519.

[13]林玳，郑怀宇.反相高效液相色谱法测定多索茶碱血浓度[J].中国药业，2010，19（21）：15-16

[14]陈锦珊，杜青云，黄惠丽，等.反相高效液相色谱法测定人血清中多索茶碱浓度[J].海峡药学，2003，15（4）：28-30.

[15]张波，刘艳，杜智敏，等.反相高效液相色谱法测定血浆中多索茶碱的浓度[J].哈尔滨医科大学学报，2004，38（1）：88-89.

[16]叶伶，金美玲.茶碱类药物的研究进展及其临床应用[J].世界临床药物，2009，30（1）：23-26.

[17]刘泽辉，张亚童，胡鑫.我院茶碱血药浓度监测及其影响因素综合性评价[J].中国新药杂志，2016，25（21）：2514-2517.

[18]罗梅娟，刘石带，黄靓.1305例茶碱血药浓度分析[J].海峡药学，2014，26（6）：150-152.

（收稿日期：2017-09-04 本文编辑：闫 佩）endprint