温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

林 云,林 娟,王国增,林梦丹,叶秀云

(福州大学生物科学与工程学院,福建省海洋酶工程重点实验室,福建 福州 350116)

0 引言

α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)是一种内切淀粉酶,可随机切断淀粉、 糖原等内部的α-1,4糖苷键,得到末端残基碳原子为α构型的水溶性糊精和低聚糖[1-3]. 根据最适反应温度的不同,可将α-淀粉酶分为低温、 中温和高温α-淀粉酶[4]. 其中,中温α-淀粉酶的最适反应温度在50～70 ℃左右,60 ℃以下较稳定,最适pH值在6.0左右[5],可应用于面包、 果汁、 葡萄糖、 味精等多种食品的生产,也可用于丝绸、 人造棉、 化学纤维的退浆等[3, 6-7].

能产生α-淀粉酶的微生物主要有芽孢杆菌属(Bacillus)[8]、 米曲霉(Aspergillusoryzae)[9]、 施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)[10]等. 目前大多数国家的酶制剂产品[11-13]以芽孢杆菌产的细菌型淀粉酶和米曲霉产的真菌型淀粉酶为主,且最适pH值大多在酸性和中性之间[13-14]. 本研究利用基因工程方法克隆表达来源于云南腾冲温泉地芽孢杆菌Geobacillussp.WQJ-1中的α-淀粉酶基因,并对重组蛋白进行分离纯化和酶学性质研究,以期获得pH稳定性和热稳定性较好的α-淀粉酶.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

地芽孢杆菌Geobacillussp.WQJ-1从云南腾冲温泉中筛选获得,pMD18-T载体购于TaKaRa公司,大肠杆菌BL21(DE3)和Trans1-T1购于全式金公司,表达质粒pET-28a(+)为本实验室保存.

1.1.2 培养基

LB培养基： Trypton 10 g,Yeast Extract 5 g,NaCl 10 g,蒸馏水1 000 mL,pH值7.0(配制固体培养基时添加20 g的琼脂),121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

1.1.3 酶和试剂

DL5000 DNA Ladder Marker、 2×Pfu PCR Master Mix和细菌基因组DNA抽提试剂盒购自TaKaRa公司； DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A Gel Extraction Kit,D2500-01)、 质粒小提试剂盒(E.Z.N.A Plasmid Mini Kit,D6492-01)、 PCR产物纯化试剂盒(E.Z.N.A Cycle Pure Kit,D6492-01)均购自Omega公司； 硫酸卡那霉素购自Sigma公司； 各种限制性内切酶购自Fermentas公司； T4 DNA连接酶购自NEB公司； 异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)购自Amresco公司； 250 ku Protein Ladder Marker、 Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)购自全式金公司.

1.1.4 常用溶液

表1 标准McIlvaine缓冲液的配制Tab.1 Preparation of standard McIlvaine buffer

标准McIlvaine缓冲液： 配制200 mmol·L-1的Na2HPO4溶液(A液)和100 mmol·L-1的柠檬酸溶液(B液),各缓冲液按照表1的比例配制.

Tris-HCl缓冲液： 配制50 mmol·L-1的Tris溶液,用适量HCl滴定至pH值为7.0、 8.0、 9.0； Gly-NaOH缓冲液： 配制50 mmol·L-1的甘氨酸溶液,用适量NaOH溶液滴定至pH值为9.0、 10.0.

展开剂： 正丁醇20 mL,冰乙酸10 mL,蒸馏水10 mL[15].

显色剂： 苯胺4 mL,二苯胺4 g,磷酸20 mL,溶解于200 mL丙酮[15].

1.2 方法

1.2.1Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因的克隆

选择切除信号肽序列的Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因(即成熟肽基因)进行克隆表达. 应用Primer Premier 5.0软件,根据Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶的基因序列及表达质粒pET-28a(+)的酶切位点设计引物,在上、 下游引物5′端分别引入SacⅠ位点和XhoⅠ位点：

上游引物(WQJ-F)： 5′-ATAGAGCTCGCCGCACCGTTTAACGGCACCATGATG-3′

下游引物(WQJ-R)： 5′-TATCTCGAGTGGCCATGCCACCAACCGTGGTTCG-3′

以Geobacillussp.WQJ-1基因组DNA为模板进行PCR扩增. 50 μL PCR反应体系： 模板3 μL,2×Pfu PCR Master Mix 25 μL,引物各1.5 μL,超纯水19 μL. PCR扩增条件： 94 ℃,5 min； 94 ℃,30 s,62.1 ℃,30 s,72 ℃,90 s,30个循环； 72 ℃,3 min.

将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳确证后,利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因.

1.2.2 重组质粒构建

用SacⅠ和XhoⅠ将纯化的目的基因双酶切并进行DNA纯化,与进行同样双酶切并回收的表达质粒pET-28a(+)用T4 DNA连接酶于4 ℃过夜连接,得到重组质粒,转化Trans1-T1细胞,经卡那霉素筛选、 菌落PCR验证并测序得到阳性克隆,将其接入含20 μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中,37 ℃、 200 r·min-1条件下过夜培养,用Omega公司的质粒小提试剂盒提取质粒.

1.2.3α-淀粉酶基因表达与纯化

利用热激法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3) 表达宿主细胞,经卡那霉素筛选、 菌液PCR验证并测序得到阳性克隆,挑取阳性克隆接入含20 μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中,37 ℃、 200 r·min-1条件下过夜培养,然后按1%的接种量接种到含相同抗生素浓度的50 mL LB培养基中,继续培养至OD600为0.4～0.6时,加入终浓度1 mmol·L-1的IPTG,于30 ℃诱导表达12 h. 取培养物在12 000 r·min-1下离心5 min. 用5 mL 0.2 mol·L-1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH=6.0)重悬菌体,超声破碎(功率25%,超声时间4 s,间隔时间5 s,超声次数200次). 破碎后于4 ℃、 12 000 r·min-1下离心5 min,收集上清,测定酶活力大小,并将上清过镍柱进行纯化[16].

1.2.4α-淀粉酶活力测定

取900 μL 5 mg·mL-1的可溶性淀粉溶液,于一定温度下预热2 min,加入100 μL酶液反应20 min,用DNS法测定产生的还原糖[17]. 酶活力单位(U)定义为： 淀粉酶在合适的缓冲液、 温度、 pH值等条件下,每分钟从可溶性淀粉中释放出1 μmol还原糖所需要的酶量.

1.2.5α-淀粉酶酶学性质研究

最适反应pH值的测定： 在75 ℃条件下,分别测定α-淀粉酶在不同pH值缓冲液(pH=4.0～10.0)中的酶活力,设定最高的酶活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

pH稳定性的测定： 将酶液置于不同pH值缓冲液(pH= 4.0～10.0)中,于37 ℃条件下保温1 h,在最适反应条件下测定酶活力,设定最高的酶活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

最适反应温度的测定. 在最适反应pH值条件下,分别测定α-淀粉酶在不同温度(50～90 ℃)条件下的酶活力,设定最高的酶活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

Ca2+对α-淀粉酶热稳定性的影响. 在酶液中分别添加5、 10、 15 mmol·L-1Ca2+,于不同温度(70、 75、 80 ℃)下保温,分别在2、 3、 10、 15、 20、 30、 60 min时取样并立即置于冰上,在最适反应条件下测定酶活力,设定未经过处理的酶液活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

金属离子和化学试剂对α-淀粉酶活力的影响. 在酶促反应体系中分别加入终浓度为1和5 mmol·L-1的K+、 Na+、 Ca2+、 Li+、 Co2+、 Cr3+、 Ni2+、 Cu2+、 Mg2+、 Fe2+、 Mn2+、 Zn2+、 Ag+、 Hg2+、 Al3+、 EDTA、 SDS和β-巯基乙醇,在最适反应条件下测定酶活力,设定同样条件下未加金属离子和化学试剂所测得的酶活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

α-淀粉酶动力学参数的测定. 根据李宁[18]的方法,测定反应的一级反应时间为10 min. 配制不同浓度可溶性淀粉底物(1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 mg·mL-1),在最适反应条件下测定酶活力,计算反应速度,利用Lineweaver-Burk 法[19]求得Km值及vmax.

α-淀粉酶的底物特异性. 分别以5 mg·mL-1的可溶性淀粉、 木薯淀粉、 马铃薯淀粉、 玉米淀粉、 糊精(玉米)、β-环状糊精、 普鲁兰多糖为底物,在最适反应条件下测定酶活力,设定以可溶性淀粉为底物测得的酶活力为100%,其余与之相比得到相对酶活力.

α-淀粉酶水解产物的分析. 用最适反应pH值的缓冲液配制5 mg·mL-1木薯淀粉溶液,向4.5 mL淀粉底物中加入0.5 mL酶液,混匀后置于最适反应温度下保温不同时间,分别取样并用硅胶板薄层色谱的方法分析[20].

2 结果与分析

2.1 Geobacillus sp.WQJ-1 α-淀粉酶基因的全长序列分析

Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因amyWQJ全长1 614 bp,编码537个氨基酸和一个终止密码子,编码的rAmyWQJ蛋白预计相对分子质量为61.1 ku. 基因序列经BlastN比对后,发现多个芽孢杆菌属来源的α-淀粉酶基因序列与其相近； 经BlastP分析后,发现rAmyWQJ蛋白序列与来源于GeobacilluskaustophilusGBlys1713273A 的α-amylase(GenBank登录号GAD15124.1)蛋白序列一致性最高为100%； 对rAmyWQJ蛋白序列进行多重氨基酸序列比对分析后发现,rAmyWQJ氨基酸序列中存在α-淀粉酶家族的四个保守区段,即RegionⅠ(123DVVFDH),RegionⅡ(252GFRLDAVKH),RegionⅢ(284VGEYWS),RegionⅣ(348FVDNHD),其中Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ区段分别含有Asp256、 Glu286、 Asp353三个保守催化残基,进一步证明该基因为α-淀粉酶基因. 用Signal P4.1分析表明rAmyWQJ蛋白N端22个氨基酸为预测的信号肽(见图1),该编码蛋白与PDB中的4uzu.1.A(Geobacillusstearothermophilusα-amylase)的一致性为99.42%,以此为模板,利用SWISS-MODEL同源建模的方法构建该蛋白的3级结构,结果如图2所示,图中卷曲结构表示α螺旋,箭头结构表示β折叠,中间有2个钙离子结合位点(黑色球).

图1 α-淀粉酶rAmyWQJ信号肽预测Fig.1 Signal peptide prediction of α-amylase rAmyWQJ.

图2 α-淀粉酶rAmyWQJ三维结构图Fig.2 Three-dimensional structures of α-amylase rAmyWQJ

2.2 Geobacillus sp.WQJ-1 α-淀粉酶基因的克隆

图3 α-淀粉酶基因的PCR扩增电泳图Fig.3 PCR amplification electrophoresis of α-amylase gene

以Geobacillussp.WQJ-1基因组DNA为模板,以WQJ-F和WQJ-R为引物,PCR扩增α-淀粉酶成熟肽基因. 核酸电泳显示其条带在1 500 bp左右,与理论基因长度相符(见图3).

割胶回收PCR产物,连接pMD18-T载体,转化验证,将阳性重组子送上海英潍捷基公司测序,测序结果表明插入的序列是正确的.

2.3 原核表达载体pET-28a(+)-amyWQJ的构建

将α-淀粉酶成熟肽基因amyWQJ连接pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a(+)-amyWQJ,转化Trans1-T1感受态细胞,菌液PCR验证后挑选阳性克隆子委托上海英潍捷基公司测序,测序结果表明插入的序列是正确的.

2.4 α-淀粉酶基因的表达与纯化

图4 纯化后重组酶rAmyWQJ的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rAmyWQJ

如图4所示进行纯化后重组酶rAmyWQJ的SDS-PAGE分析. 利用质粒提取试剂盒提取确证的重组载体,并将其转化表达宿主BL21(DE3)感受态细胞,经1 mmol·L-1的IPTG诱导表达目的蛋白,超声破碎、 离心,测得上清液的α-淀粉酶活力为173.0 U·mL-1； 无IPTG诱导时,细胞破碎液中α-淀粉酶的活力为163.1 U·mL-1,这可能是因为α-淀粉酶基因amyWQJ在大肠杆菌中存在微量表达,而培养基中存在一些物质可能被该酶分解,之后生成具有诱导作用的小分子. 同时在含空载pET-28a(+)的对照菌株中没有检测到α-淀粉酶活性,这说明α-淀粉酶基因amyWQJ在大肠杆菌中成功表达. 经镍柱纯化后,得到大小约59 ku的单一蛋白条带,与该α-淀粉酶成熟蛋白的理论相对分子质量相当.

目前商品化的α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌,表2列出了应用基因工程技术表达不同来源α-淀粉酶的情况,表明α-淀粉酶基因amyWQJ在大肠杆菌中得到较好的表达.

表2 应用基因工程技术表达不同来源的α-淀粉酶基因Tab.2 Applications of genetic engineering technology to express α-amylases

2.5 重组α-淀粉酶rAmyWQJ的酶学性质研究

2.5.1 pH值对重组酶rAmyWQJ活力的影响

纯化后的重组α-淀粉酶rAmyWQJ的最适反应pH值为6.0,pH值在5.0～9.0之间,可保持58.7%以上的相对酶活力(见图5),属于中性淀粉酶. 该酶的pH稳定性较好,在pH值5.0～10.0的缓冲液中,于37 ℃保温1 h,仍能保持60%以上的酶活力(见图6).

图5 pH值对重组酶rAmyWQJ活力的影响Fig.5 Effect of pH value on recombinant rAmyWQJ activity

图6 重组酶rAmyWQJ的pH稳定性Fig.6 pH stability of recombinant rAmyWQJ

2.5.2 温度对重组酶rAmyWQJ活力的影响

图7 温度对重组酶rAmyWQJ酶活力的影响 Fig.7 Effect of temperature on recombinant rAmy- WQJ activity

图7为温度对重组酶rAmyWQJ酶活力的影响. 由图7可见,重组酶rAmyWQJ的最适反应温度为70 ℃,表明该酶为中温淀粉酶.

2.5.3 Ca2+对重组酶rAmyWQJ热稳定性的影响

α-淀粉酶含有一个以上的Ca2+结合位点,Ca2+的存在可稳定酶分子的构象,从而提高α-淀粉酶活性和稳定性[28-29].

无Ca2+存在的情况下,重组酶rAmyWQJ在70 ℃保温20 min,基本丧失活力. 但在添加5、 10、 15 mmol·L-1Ca2+的情况下,酶的热稳定性有很大的提高. 在70 ℃保温60 min,分别残留33.6%、 68.9%、 74.7%的酶活力(见图8(a))； 在75 ℃下,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+,保温60 min,分别残留47.6%和65.8%的酶活力(见图8(b))； 在80 ℃下,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+,保温60 min,分别残留34.7%和38.6%的酶活力,而添加5 mmol·L-1Ca2+,保温60 min,仅剩约10%的酶活力(见图8(c)). 由此说明Ca2+对该酶在70、 75、 80 ℃等较高温度下的热稳定性影响很大,而10、 15 mmol·L-1Ca2+能显著提高重组酶rAmyWQJ的热稳定性.

图8 添加不同浓度Ca2+对重组酶rAmyWQJ热稳定性的影响Fig.8 Effect of different concentration Ca2+on thermostability of recombinant rAmyWQJ

2.5.4 金属离子和化学试剂对淀粉酶活力的影响

α-淀粉酶是金属酶,很多金属离子(特别是重金属离子)及金属螯合剂对其有抑制作用. 表3显示18种两个不同浓度(终浓度1和5 mmol·L-1)的金属离子及化学试剂对重组酶rAmyWQJ活力的影响. 其中在1 mmol·L-1浓度下,Hg2+完全抑制了重组酶rAmyWQJ的活力； 在5 mmol·L-1浓度下,EDTA和SDS分别抑制酶活力的26.7%和25.8%,Cr3+、 Mn2+、 Cu2+和Pb2+对该酶有轻微的抑制作用,分别抑制酶活力的10.0%、 11.8%、 19.1%和13.9%； Co2+、 Na+、 Ca2+和β-Mercaptoethanol对该酶有促进作用,其中5 mmol·L-1的β-Mercaptoethanol对酶的促进作用最大,酶活力提高15.4%.

表3 不同金属离子及相关化学试剂对重组酶rAmyWQJ活力的影响Tab.3 Effects of different metal ions and chemicals on recombinant rAmyWQJ activity (%)

2.5.5α-淀粉酶动力学参数的测定

以不同浓度的可溶性淀粉为底物测定α-淀粉酶活力,利用Linewaeaver-Burk作图法,以底物质量浓度ρ的倒数1/ρ为横坐标、 反应速率v的倒数1/v为纵坐标作图,结果如图9所示. 经计算Km=6.62 mg·mL-1,vmax=2 197.80 μmol·(mg·min)-1.

2.5.6 重组酶rAmyWQJ的底物特异性

表4为重组酶rAmyWQJ的底物特异性,由表4可知,重组酶rAmyWQJ的最适作用底物是木薯淀粉,其次是可溶性淀粉、 玉米淀粉和马铃薯淀粉,而该酶对糊精(玉米)的降解效率仅为对可溶性淀粉降解效率的33.0%,检测不到该酶对β-环状糊精和普鲁兰多糖有降解作用.

2.5.7α-淀粉酶水解产物的分析

采用硅胶板薄层色谱分析重组酶rAmyWQJ水解木薯淀粉的终产物,结果如图10所示. 由图10可知,木薯淀粉在该酶作用下,最终主要转化生成麦芽六糖和麦芽七糖,还有其他不同聚合度的糊精,表明该酶为内切酶,能切开淀粉分子内部α-1,4-糖苷键,将木薯淀粉降解成水溶性的糊精和低聚糖.

图9 重组酶rAmyWQJ的Lineweaver-Burk图Fig.9 Lineweaver-Burk plot of recombinant rAmyWQJ

图10 重组酶rAmyWQJ的水解产物分析(TLC法)Fig.10 Final hydrolysates analysis of recombinant rAmyWQJ表4 重组酶rAmyWQJ的底物特异性Tab.4 Substrate affinity of recombinant rAmyWQJ

(%)

3 结语

本研究克隆了Geobacillussp.WQJ-1的α-淀粉酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,酶活力为173.0 U·mL-1,相对分子质量大小约为59 ku. 酶学性质研究表明,该重组酶最适反应pH值和温度分别为6.0和70 ℃,在pH5.0～10.0的范围内具有较好的稳定性,属于中温、 中性α-淀粉酶. Ca2+能显著提高重组酶在70、 75、 80 ℃等较高温度下的热稳定性,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+在80 ℃下保温60 min,仍能保留35%左右的酶活力. Hg2+、 EDTA 和SDS对该酶有显著的抑制作用,Co2+、 Na+和β-Mercaptoethanol对该酶有促进作用,在工业应用中添加Co2+、 Na+和β-Mercaptoethanol可简化生产工艺,降低生产成本. 以可溶性淀粉作为底物,经计算得该酶的动力学参数Km为6.62 mg·mL-1,vmax为2 197.80 μmol·(mg·min)-1. 酶的底物特异性实验结果显示其最适作用底物是木薯淀粉,其次是可溶性淀粉、 玉米淀粉和马铃薯淀粉. 经薄层层析分析,该酶水解木薯淀粉主要生成麦芽六糖和麦芽七糖,还有其他不同聚合度的糊精,表明该酶为内切酶.

由于该酶属于中温、 中性的内切α-淀粉酶,且具有较强的pH稳定性,因此在食品行业中面包的制作及其他食品的前处理、 饲料添加剂中动物生产性能的提高、 丝绸、 人造棉、 化学纤维等行业具有良好的开发应用价值.

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