石斛合剂序贯法对糖尿病合并肝纤维化大鼠的影响

周 勇，施 红，林心君，余文珍

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

据WHO数据显示1994年糖尿病患者人数为1.2亿，2014年全世界有3.87亿糖尿病患者，预计到2025年全球将突破40亿人［1］。随着糖尿病发病率不断攀升，死亡率也随之升高。众所周知，在糖尿病的发生发展过程中，并发症也相继出现，如视网膜病变、肝肾病变及周围神经病变等。以往关于糖尿病相关并发症研究较多，近几年T2DM合并肝损伤逐渐引起相关人士关注，大量研究表明T2DM会增加肝脏发生纤维化并进一步发展为肝硬化或肝癌的风险，其成为了糖尿病死亡率升高的一个重要因素［2］。

1 实验材料

1.1 实验动物 36只SPF级Wistar雄性大鼠，体质量（105±5）g。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012—0002。

1.2 实验药物和试剂 石斛合剂序贯方（石斛、黄芪、五味子、丹参、川牛膝、生地黄、地龙等）购自福建中医药大学附属第三人民医院；盐酸二甲双胍片（山东明仁福瑞达制药有限公司）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；玉米油、CCl4（上海麦克林生化科技有限公司）。

1.3 实验仪器 尼康生物显微镜（日本尼康公司，55I）；低温离心机（美国 Thermo 公司，Multifuge X3R）；分析天平（奥豪斯仪器有限公司，CP214）。

2 实验方法

2.1 石斛合剂序贯方汤剂的制备 石斛合剂序贯方（1方、2方）以常规水煎2次后合并、过滤。采用旋转浓缩，配制成石斛合剂1方含生药量1.7 g／mL、石斛合剂 2 方 1 g／mL。

2.2 动物模型的建立 将36只大鼠按体质量随机抽取 8只作为正常对照组，其他大鼠先予高糖高脂饲料 （含60.7%基础饲料、15%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、4%胆固醇、0.3%胆酸盐）饲养42 d后，继以低剂量STZ（25 mg／kg，柠檬酸缓冲液配制，pH＝4.2～4.6，现配现用）一次性腹腔注射，继予高脂高糖饲料喂养，于注射第4、5天用微量血糖测定仪测量空腹血糖，筛选出2次连续测量血糖≥11.1 mmol／L的大鼠，即为糖尿病模型大鼠，不满足者剔除。糖尿病模型成功后再按大鼠体质量0.2 mL／100 g皮下注射40%CCl4，每周2次，共 6周，建立糖尿病合并肝纤维化模型大鼠。

2.3 分组及干预 糖尿病模型大鼠按体质量和血糖进行随机分层分组，分为模型对照组、二甲双胍组、石斛合剂组各8只。石斛合剂组为先予石斛合剂 1 方按 17 g／（kg·d）灌胃 6 d，继予石斛合剂 2 方按 10 g／（kg·d）灌胃 3 d，如此循环；二甲双胍组予二甲双胍按 0.1 g／（kg·d）灌胃；正常对照组、模型对照组予等量生理盐水灌胃。4组均灌胃干预6周。

2.4 观测指标

2.4.1 血糖 采用尾静脉采血，检测4组大鼠灌胃干预前后的血糖。

2.4.2 血清AST、ALT浓度 采用紫外比色法测定4组大鼠灌胃干预前后血清AST、ALT浓度。

2.4.3 肝脏HE染色及Masson染色 采用HE染色及Masson染色观察4组大鼠干预后肝脏组织形态。取肝脏常规石蜡包埋切片，观察肝细胞排列及胶原纤维的表达量。

2.4.4 肝纤维化四项 采用ELISA法检测4组大鼠干预后血清肝纤维化四项（HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ）。

2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析处理，符合正态分布的计量资料以（）表示，采用单因素方差分析，非正态分布采用秩和检验。

3 实验结果

3.1 4组干预前后血糖浓度比较 见表1。

表1 4组干预前后血糖浓度比较（）mmol／L

表1 4组干预前后血糖浓度比较（）mmol／L

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型对照组比较，2）P＜0.01；与干预前比较，3） P＜0.01。

干预后4.78±0.41 19.80±4.761）7.10±1.852）3）6.56±4.882）3）组 别正常对照组模型对照组石斛合剂组二甲双胍组n 8 8 8 8干预前4.76±0.37 21.12±6.571）17.35±7.251）21.68±6.571）

3.2 4组干预后AST、ALT浓度比较 见表2。

表2 4组治疗后AST、ALT浓度比较（）mmol／L

表2 4组治疗后AST、ALT浓度比较（）mmol／L

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与模型对照组比较，3） P＜0.01。

ALT 55.26±3.76 165.81±4.501）77.73±6.862）3）91.86±13.242）3）组 别正常对照组模型对照组石斛合剂组二甲双胍组n 8 8 8 8 AST 76.30±5.54 283.10±15.501）108.23±5.722）3）102.76±15.502）3）

3.3 肝脏形态学观察

3.3.1 HE染色 如图1所示，正常对照组肝细胞排列整齐、结构完整；模型对照组肝细胞排列紊乱，有大量炎性浸润，且在汇管区可见大量纤维组织；二甲双胍组和石斛合剂组炎性浸润减少，纤维组织较模型对照组明显减少。

3.3.2 Masson染色 如图2所示，正常对照组中央静脉区少量胶原纤维沉积；模型对照组汇管区合中央静脉区有大量胶原纤维沉积；二甲双胍组与石斛合剂组中央静脉区虽仍有胶原纤维沉积，但与模型对照组比较明显减少，且石斛合剂组减少更明显。

3.4 4组干预后肝纤维四项指标比较 见表3。

图1 4组大鼠肝脏HE染色图（×20）

图2 4组大鼠肝脏Masson染色图（×20）

表3 4组干预后肝纤维四项指标比较（）ng／mL

表3 4组干预后肝纤维四项指标比较（）ng／mL

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与模型对照组比较，2）P＜0.01。

LN 65.13±6.54 350.51±31.841）79.52±5.942）87.70±8.942）组 别正常对照组模型对照组石斛合剂组二甲双胍组n 8 8 8 8 HA 126.73±9.62 367.95±10.741）175.72±3.821）2）183.00±13.181）2）PC-Ⅲ39.94±1.71 243.46±31.671）48.12±2.552）43.44±3.282）C-Ⅳ70.79±3.38 124.83±47.951）84.46±2.982）81.04±11.772）

4 讨论

血糖升高是糖尿病的主要特征，在其发病的过程中会产生诸多并发症，如视网膜、肾脏、心脏、脑及足等发生病变，同时也会产生许多有害因子。糖基化终产物在糖尿病患者体内过度累积，引起肝组织中氧化应激反应和炎症反应而损伤肝细胞［3］，当肝脏受到炎性损伤时，肝星状细胞由静止状态转变为激活状态。肝星状细胞激活后转化为肌成纤维细胞是肝纤维化必经途径，这一观点得到大多数人的认可，肝星状细胞被激活，分泌细胞外基质过度沉积，大量合成α-SMA，最后导致肝纤维化。有研究发现，肝脏疾病也是糖尿病发病率较高的一个并发症，糖尿病性肝病发病率为7.24%，2型糖尿病并发脂肪肝患病率高达55%［4-5］。在糖尿病与肝纤维化关系的广泛研究中，已有证据显示糖尿病是肝纤维化及肝硬化发生的一个重要危险因素［6-8］。

糖尿病核心病机是由各种病因引起全身气机阻滞，酿生痰湿，郁而化热，灼伤津液，导致阴虚燥热，继而引起痰湿热交结，滋生浊毒加重痰湿热，最终导致阴阳两虚，且瘀血、尤其是经脉瘀阻贯穿整个发病始终。石斛合剂序贯方由石斛合剂1方和石斛合剂2方组成。石斛合剂1方由石斛、黄芪、丹参、知母、生地、葛根、五味子、地龙等组成，益气养阴，活血通络。石斛中润胃阴，下滋肾阴，滋而不腻；黄芪托毒又补脾肺之气，两药合用，肺脾肾三脏之气阴同补，上中下三焦兼顾，共为君药。知母、生地清热凉血，滋阴生津润燥，壮水制火；丹参活血凉血，祛瘀生新；地龙清热息风，通络利尿，共为臣药。葛根升发脾胃之清阳，生津止渴；五味子敛肺滋肾生津，宁心涩精，一散一收，化而能守，佐助君药滋阴益气之功效，共为佐使药。诸药相须为用，上中下兼顾，甘温化气，酸甘养阴，苦寒清热，润燥解毒，三消分治兼清瘀血。石斛合剂2方由茵陈、栀子、大黄、柴胡、滑石、甘草等组成，清肝泄浊，清利湿热。茵陈清利湿热，清热解毒；栀子通利三焦，引湿热自小便而出，二者共为君药。大黄炀灶减薪，泻热逐瘀，祛其西道壅塞；柴胡疏肝解郁，清其东道邪热，共为臣药。滑石甘寒淡渗，以佐清利湿热之力。甘草调和诸药。全方药简力专，使二便通利，前后分消，湿热得行，痰瘀得化，浊毒得去。

本研究通过高脂高糖联合腹腔注射STZ及皮下注射CCl4建立糖尿病合并肝纤维化模型。高脂高糖饲喂6周后联合小剂量STZ（25 mg／kg）建立糖尿病模型，在此过程中，3只大鼠因空腹血糖＜11.1 mmol／L，不符合糖尿病模型筛选标准，舍去，造模成功率为89.29%；糖尿病成模后，再以2 mL／kg CCl4皮下注射，建立糖尿病合并肝纤维化模型，1只大鼠因皮下注射过程中操作不当死亡。经过石斛合剂序贯方治疗6周后，大鼠空腹血糖、肝功能（AST、ALT）明显改善，肝纤维化四项也明显降低，且石斛合剂组优于二甲双胍组。病理活检是诊断肝纤维化金指标，从肝脏组织形态学可知石斛合剂组和二甲双胍组胶原纤维蛋白沉积明显较模型对照组减轻，且石斛合剂组减轻更明显，其具体可能的机制有待进一步研究。

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