XpertMTB/RIF与BACTECMGIT960检测结核分枝杆菌及利福平耐药差异性

陈俊林+黄飞+徐费凡

[摘要] 目的 探讨Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960在检测结核分枝杆菌（MTB）及利福平（RFP）耐药性出现差异的原因。方法 选择2014年6月～2017年6月在南通市第六医人民院就诊的188例复治肺结核患者的涂阳痰标本作为研究对象，分别采用Xpert MTB/RIF及BACTEC MGIT960检测MTB及RFP耐药性并结合患者用药史对结果进行分析。结果 两种方法检测出一致性结果146例，差异性结果38例。使用过含利福霉素类药物且用药时间>3个月病例组，Xpert MTB/RIF检测出的RFP耐药性病例数高于BACTEC MGIT960，差异有统计学意义（χ2 = 6.31，P < 0.05），其余各组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960检测涂阳痰标本MTB及RFP耐药性会出现部分差异性结果，可能与患者的用药史有关，临床医师应重视两种检查方法的差异性并准确制订抗结核治疗方案。

[关键词] 结核分枝杆菌；利福平；药敏试验；XpertMTB/RIF；BACTEC MGIT960

[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0049-04

[Abstract] Objective To explore the differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting Mycobacterium tuberculosis （MTB） and Rifampin （RFP） resistance. Methods From June 2014 to June 2017， sputum specimens from 188 retreated smear positive pulmonary tuberculosis patients in the Sixth People's Hospital of Nantong were selected as research objects. Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 were used to detect MTB in the sputum specimens of the patients and the RFP resistance was analyzed combined with the medical history. Results Then were 146 cases of consistency results between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB， while 38 cases of heterogeneity. The number of cases in Xpert MTB/RIF group was higher than that of BACTEC MGIT960 group in the use of the drug with rifamycin and the duration above 3 months， with statistically significant difference （χ2=6.31，P < 0.05）. There were no statistically significant differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in the comparison of other medical history groups （P > 0.05）. Conlusion The results of Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB and RFP resistance from sputum specimens of smear positive are differential. It may be associated with medical history of the patients. Clinical physicians should pay attention to the differences of the two detection methods and formulate anti-tuberculosis treatment plan accurately.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Rifampicin； Drug sensitive test； XpertMTB/RIF； BACTEC MGIT960

耐利福平（RFP）结核病（MTB）的诊治仍然是国内外关注的重点[1-2]，本地区疾控机构流行病学调查显示，耐RFP结核病近几年呈明显上升趋势[3]。如果能在就诊的肺结核患者中快速、准确地发现耐RFP的MTB并及时更改抗结核治疗方案，就可以避免低浓度耐药MTB演变为高浓度耐药MTB并获得稳定遗传和繁殖。传统的罗氏培养及比例法药敏技术虽然是結核菌耐药检测的金标准，但检测需耗时1～2个月，不能满足临床需要。BACTEC MGIT960检测MTB及药物敏感性和传统的罗培药敏高度一致，耗时仅需要半月左右，可替代传统培养及药敏检测[4-5]。目前流行的XpertMTB/RIF技术检测标本中MTB及RFP耐药仅需要几小时就能报告结果，已在临床应用中得到高度评价[6-7]。但实际应用过程中发现XpertMTB/RIF技术和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐药性检测方面存在一定差异，可能会对制订抗结核方案带来困惑。基于以上原因，笔者对近3年采用这两种检测方法所得到结果进行了比较。现报道如下：endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 菌株来源 MTB标准株（H37Rv ATCC27294）购自国家菌种保藏中心，188例涂阳痰标本来自2014年6月～2017年6月在南通市第六人民医院就诊的复治肺结核患者。其中男115例，女73例，年龄27～82岁，平均（50.7±2.0）岁。对每例复治涂阳肺结核患者均详细记录用药史、症状及胸部CT检查情况。

1.1.2 主要试剂和仪器 RFP购自美国Fluka公司；Bactec MGIT检测仪、Bactec MGIT试剂、61010A-1型比浊仪购自美国BD（Becton Dickinson）公司；GNP-92700隔水式培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；GeneXpert仪器及Xpert MTB/RIF检测试剂盒购自美国Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片检测 按照《结核病诊断实验室检验规程》[8]中的标准化操作程序进行操作。报告方式：100倍物镜按1+～4+进行分级。

1.2.2 标本处理 取干酪样或脓样晨痰1 mL于试管内，加入4 mL 4%NaOH并进行振荡使痰液充分消化，移入37℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸盐缓冲液中和，3000 r/min 离心30 min后移入37℃水浴电热恒箱内。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作说明，吸取0.5 mL标本处理液加入到MGIT液体培养管中进行MTB培养，取阳性第3天～第5天培养管，无菌吸取1 mL陽性肉汤至4 mL无菌生理盐水中作为稀释菌液，再以此稀释菌液1∶100稀释作为对照菌液，分别以无菌方法加入500 μL对照菌液和稀释菌液于BACTEC MGIT960对照管及加有RFP的药物培养管中颠倒混匀（培养基的药物浓度为1.0 mg/mL）。放入BACTEC MGIT960培养箱中，15 d之内仪器自动报告敏感与耐药结果。质量控制：每次药敏试验均采用H37Rv标准株作为阳性参照，进行分枝杆菌液体培养及RFP药敏试验（其中RFP培养基的药物浓度为1.0 mg/mL），仪器在15 d之内自动报告敏感与耐药结果。

1.2.4 XpertMTB/RIF核酸扩增检测 按试剂说明书将之前处理后标本加入检测反应盒，上机进行检测，系统自动进行核酸提取、扩增，目标序列的检测和结果判断。2 h内判断患者是否患有结核及是否对RFP耐药。反应结束后，在检测系统窗口下直接观察测试结果[9]。结果报告：MTB检出或未检出。MTB检出报告同步显示RFP耐药的结果：△CT≥3.5，RFP耐药；△CT<3.5，RIF敏感（CT是指探针循环域值，△CT指探针早期CT值与晚期CT值之差）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学处理，计数资料采用百分率表示，两组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 188例涂阳痰标本检测结果

BACTEC MGIT960培养阴性20例，阳性168例；4例鉴定为非结核分枝杆菌，164例为结核分枝杆菌；药敏结果显示，耐RFP 46例。Xpert MTB/RIF检测结果显示，阳性177例；检出耐RFP 68例。两种方法同时检出MTB 159例，均报告为阴性 2例，同时诊断RFP耐药为40例。

2.2 BACTEC MGIT960与XpertMTB/RIF检测结果的差异比较

两种方法检测出RFP敏感或耐药一致性结果146例，差异性结果38例。2例标本BACTEC MGIT960培养阳性而Xpert MTB/RIF检出阴性，药敏报告提示对RFP敏感；18例BACTEC MGIT960培养阴性而Xpert MTB/RIF检出阳性标本，16例Xpert MTB/RIF检出RFP耐药；6例BACTEC MGIT960检测提示，RFP耐药而Xpert MTB/RIF检测提示RFP敏感；12例BACTEC MGIT960检测显示RFP敏感而Xpert MTB/RIF检测提示RFP药耐。

2.3 BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF检测RFP耐药差异性与患者用药史的关系

剔除4例鉴定为非MTB患者及2例用药史不详患者，对182例患者留痰时所记录的用药时间、用药种类进行分组，分别记录各组痰标本使用BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF检测RFP耐药结果。用药时间>3个月（含利福霉素类）痰标本组，Xpert MTB/RIF检测出的RFP耐药性病例数高于BACTEC MGIT960，差异有统计学意义（χ2 = 6.31，P < 0.05）。其余各组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3 讨论

XpertMTB/RIF和BACTEC MGIT960分别作为分子药敏检测技术代表和表型药敏检测技术代表，技术原理均非常明确，已推广应用于临床快速检测MTB及耐药性中。两者在检测MTB临床分离株及RFP耐药性方面有极高的符合率[10-12]。但本研究发现，在直接检测临床痰标本中，MTB及RFP耐药性存在一定差异，如果不能正确判读结果，可能因漏诊或误诊而造成误诊误治，将无法实现精准治疗而影响其身心健康。

有文献报道，BACTEC MGIT960检出MTB最低限量为1～10 CFU/mL，而Xpert MTB/RIF检测MTB最低限量为100 CFU/mL[13]，提示BACTEC MGIT960对微量MTB的检出能力具有优越性。但BACTEC MGIT 960仅能对标本中活菌进行检测，对已死亡的MTB则无法检测，对活力极弱的MTB如休眠菌则检出能力下降，而Xpert MTB/RIF检测的标靶为MTB特有的DNA片段，对活菌或DNA未降解的死亡MTB均具有检测能力。本组部分病例已经过有效抗结核治疗，虽然痰涂片仍然阳性，但MTB可能已死亡或接近死亡，会出现BACTEC MGIT960培养阴性而Xpert MTB/RIF检出阳性，能很好地解释本研究中Xpert MTB/RIF比BACTEC MGIT960检出率更高的反差现象。另外，在复治肺结核患者中，结核分枝杆菌L型（MTB-L）存在比例非常高[14-15]，MTB-L不易被结核药物清除，经过治疗后的痰标本中可能同时存在死亡MTB和活的MTB-L，因培养条件不同可以出现导致表型药敏技术和分子药敏技术检测结果不一致的现象，这就要求仔细分析病史及用药史才能分析两种方法检测MTB出现不一致结果的可能原因。endprint

从检测耐药性能看，BACTEC MGIT960是现今最好的自动化MTB表型药敏检测系统，能检出标本中微量耐药MTB，但对死亡的MTB、休眠MTB、MTB-L等无法进行药敏检测。XpertMTB/RIF所采用精密设计的分子探针能高效检测到rpoB核心区基因突变情况，而rpoB基因具有鉴定RFP耐药菌株的能力[16-17]。理论上XpertMTB/RIF对活的MTB、MTB-L或DNA未降解的死亡MTB均具有RFP耐药检测能力，基本涵盖MTB各种可能存在状态，因此仅有XpertMTB/RIF报告检测到送检标本中存在耐药菌而MGIT960培养阴性或者报告对RFP敏感，要谨慎改变治疗方案。如果标本中存在异质性耐药现象[18]，rpoB基因发生突变的MTB比例过低，Xpert MTB/RIF可能无法检测到耐RFP的MTB而BACTEC MGIT960检测到对RFP耐药MTB，可能要对治疗方案进行调整。

本研究结果显示，使用XpertMTB/RIF技术和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐药性检测方面存在一定差异，与复治涂阳肺结核患者是否使用了包含RFP抗结核药物组成的方案及用药时间有一定相关性。正是因为患者送检痰标本的时间节点不同，即有的患者送痰标本时未开始接受治疗，有的正在接受治疗或有的已经过长时间治疗，有的治疗方案中包含RFP，这时痰标本中MTB存在状态可能出现多样性，最终导致了BACTEC MGIT960和XpertMTB/RIF檢测结果的差异性。因此，当快速取得Xpert MTB/RIF检测报告时，要谨慎判读检测结果，最好结合用药史或者等待BACTEC MGIT960药敏检测结果再合理调整治疗方案[19]。但BACTEC MGIT960药敏检测同XpertMTB/RIF相比较仍耗时较长，不能充分满足临床诊断需要，因此，建议有条件的专科医院可同时进行MTB-L和结核RNA检测。MTB-L培养鉴定需要较长时间，仅能作为最终抗结核方案调整依据，而要快速准确解读Xpert MTB/RIF检测报告意义，同时检测痰标本中结核RNA是非常理想的方法。目前检测结核RNA的新技术SAT-TB[20]，其技术原理是以MTB特异的16srRNA为检测靶标，通过恒温扩增技术扩增RNA靶标片段，对荧光标记的探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号进行实时检测得到阳性结果，从临床标本处理到最终报告结果仅需几小时，从而快速准确地判断待检样本中是否有MTB存在。SAT-TB与基于DNA为模板的核酸扩增技术如XpertMTB/RIF相比，该技术只检测活的MTB，因为MTB死亡后RNA便降解[21]，但DNA存在于活和死亡的MTB中，因此使用SAT-TB技术检测RNA能弥补XpertMTB/RIF不能区别死菌与活菌的缺陷，提高快速准确诊断能力。

本研究仅统计了两种方法检测涂阳痰标本的结果，没有将涂阴培阳或涂阴培阴标本纳入，是为了便于对检测结果进行客观分析。因检测样本有限，需要更大样本来验证相关数据。总之，因痰标本中MTB存在状态可能会导致BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF检测结果出现一定差异，关键是对得到的差异结果进行认真判断，避免误诊或漏诊。

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（收稿日期：2017-09-28 本文编辑：王 娟）endprint