一种含挥发油包合物的前期提取工艺研究

李春花+李佳佳+顿佳颖

[摘要] 目的 筛选最佳的挥发油包合物前期处理工艺。 方法 本研究以有机溶剂类型、有机溶剂的体积、提取时间为考察因素，以桂皮醛含量为评分指标，采用水蒸气蒸馏法提取包合物，通过L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。色谱条件：程序升温：90～180℃；进样量：1 μL，分流比为50：1。 结果 优选的最佳工艺为选择溶剂正丁醇，体积为2 mL，提取2 h。并且溶剂体积对本次实验有显著性影响。 结论 优选的最佳提取工艺通过验证科学可行，可广泛应用于包合物研究。

[关键词] 包合物；挥发油；提取工艺；桂枝；桂皮醛

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0031-04

[Abstract] Objective To screen the best pretreatment technology of volatile oil inclusion compound. Methods The research on factors and the type of organic solvent， solvent volume， extraction time， the content of cinnamic aldehyde as the score index， inclusion extracted by steam distillation method， through L9（34） orthogonal test， the optimum extraction process. Chromatographic conditions： temperature programmed： 90-180℃； injection volume： 1 μL； split ratio was 50：1. Results The optimum process was the extraction of n-butanol， the volume was 2 mL， and the extraction time was 2 hours. And the volume of solvent had significant influence on this experiment. Conclusion The optimum extraction process is proved to be scientific and feasible， and it can be widely used in inclusion complex study.

[Key words] Inclusion compound； Volatile oil； Prophase treatment； Organic solvent； Cassia twig and cinnamaldehyde

挥发油也称精油，是存在于植物中的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏、与水不相混溶的油状液体的总称。挥发油大多具有芳香气味，所以又称为芳香油[1]。挥发油的生物活性多样[2-5]，如具有止咳、平喘、祛痰、消炎、镇痛和强心等作用。挥发油拥有如此之多的疗效作用，在中药制剂中应用广泛，目前挥发油多采用直接溶解喷洒或加入适当增溶剂以制备成各种制剂。该法虽简单易行，但稳定性差，在存储过程中随时间的推移而散失，难以长期保存，应用上有一定的局限性。而采用环糊精包合后形成包合物，增加了挥发油的溶解度、增加稳定性、提高了挥发油的利用率，又可以使液体药物粉末化，便于加工成其他剂型[6-9]。实验中若想控制包合物中挥发油质量，需将其提取，定量，用气相色谱仪来测定。如何有效地将包合于环糊精的挥发油提取出来，是包合物研究的一个关键共性问题。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

安捷伦7890B GC B.02.03.2（安捷伦科技公司），配备有SPH-300氢气发生器（北京中惠普分析技术研究所），SPB-3全自动空气源（北京中惠普分析技术研究所）；分析天平（上海精科仪器厂，TG328B）；LQ-A10002电子天平（上海乐祺精密电子厂）；KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

桂枝购自安国药材市场，经河北中医学院侯芳洁老师鉴定符合2015版药典一部相关项下规定；无水硫酸钠（分析纯，深圳市中发源生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；石油醚（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；环己烷（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；β-环糊精（分析纯，山东滨州化学试剂厂）；桂皮醛（批号：H02M6Q1，纯度：98%，上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 挥发油的制备

称取桂枝150 g，加8倍量的水，浸泡2 h，提取4 h，得到桂枝挥发油。将所收集的挥发油，经无水硫酸钠干燥，在转速3000 r/min的条件下离心6 min。即得桂枝挥发油。

2.2 包合物的制备

称取β-环糊精（β-CD）10 g置烧杯中，加2倍量蒸馏水，使之完全溶解成环糊精的饱和溶液。取“2.1”项下制备的挥发油1 mL，用无水乙醇溶解（挥发油∶无水乙醇=1∶1，V/V），缓慢滴入具有一定温度的β-CD溶液中，边加边研磨，滴完之后继续人工研磨至规定时间后自然冷却至室温下，放入4 ℃冰箱冷藏24 h，抽滤，用无水乙醇洗涤3次，5 mL/次，至表面无挥发油残留，并于40℃条件下真空干燥4 h，取出，即得干燥包合物。

2.3 正交试验优选包合物前期处理工艺

在预实验的基础上，称取包合物9份，选定有机溶剂（A）、有机溶剂的体积（B）、提取时间（C）为3个主要影响因素，每个因素设计3个水平，采用L9（34）正交表安排实验，按照本发明提供的方法提取包合物按桂皮醛的含量为评价指标，通过气相色谱进行含量测定。因素水平表见表1。由正交试验结果可知，3个因素对实验结果影响的大小顺序依次为：B>C>A，即：溶剂体积>提取时间>溶剂选择（表2）。方差结果表明，溶剂体积对本次实验有显著性影响，结合正交试验结果确定最佳提取工艺为：A3B3C2，即：选择溶剂为正丁醇，体积为2 mL，提取2 h（表3）。endprint

2.4 GC测定桂皮醛含量的方法学考察

2.4.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦Hp-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升温：初始温度90℃，保持2 min；以3℃/min的速率升至140℃，保持6 min；再以7℃/min的速率升温至180℃，保持5 min；进样量：1 μL，分流进样，分流比为50∶1；载气为N2，氢火焰离子化检测器（FID）；进样口温度为200℃，检测器温度为250℃；空气流速390 mL/min，氢气流速36 mL/min，尾吹15 mL/min，氮气流速1 mL/min[10-12]。见图1。

2.4.2 对照品溶液的制备 取桂皮醛对照品适量，精密称定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得桂皮醛浓度为2.19 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.4.3 供试品溶液的制备 取“2.2”项下包合物于圆底烧瓶中，加150 mL蒸馏水，混合均匀，水蒸气蒸馏提取，在挥发油提取器上端加入一定量的有机溶剂，收集挥发油，提取结束后将有机溶剂补齐至原量，转移置5 mL容量瓶中，加有机溶剂定容，得到供试品溶液。装置见图2。

2.4.4 标准曲线的制备 取“2.4.2”项下的标准品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，分别进样1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，测定并记录峰面积，并以峰面积为纵坐标（Y），含量（mg）为横坐标（X）进行回归，得桂皮醛的线性回归方程：Y=64706X+1.7498（R=0.9995，n=5），并在2.19～10.95 μg范围内，呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 取“2.4.2”项下的对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，进样体积为1.0 μL，记录色谱图，计算得到目标峰峰面积的RSD为1.45%（n=6）。

2.4.6 稳定性试验 照“2.4.3”制备供试品溶液，于配制后0、2、4、6、8、10 h注入气相，按上述色谱条件进行检测，分别记录桂皮醛的峰面积值，计算得到RSD为0.80%（n=6）。

2.4.7 重复性试验 称取同一批包合物共6份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件记录桂皮醛的峰面积，并计算得到该样品含量的RSD为1.00%（n=6）。

2.4.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液9份，于10 mL容量瓶中，3份为一组，加入对照品溶液0.67、1.33、1.99 mL，甲醇定容，测定，得到桂皮醛的平均加样回收率为97.96%，RSD值为1.27%（n=9）。具体数据见表4。

2.5 最佳提取工艺验证试验

取桂枝挥发油包合物共3份，分别按最佳处理工艺A3B3C2进行验证实验，经气相测定，得到桂皮醛峰面积；将已知含量的挥发油进行气相测定，得到桂皮醛峰面积，与最佳处理工艺得到的结果进行比较，可以得到浓度，从而进一步计算得到提取效果。

按上述所确定的最佳工艺提取桂枝挥发油包合物3份，测定桂皮醛含量，比正交表9组实验中的桂皮醛含量都高，说明本次正交试验所筛选的工艺是合理、可行的，效果较好。见表5。

3 讨论

葶苈生脉组方是全国名老中医邢月朋根据多年临床经验总结出的治疗气虚血瘀、阳虚水停型CHF的经验方，组方中的桂枝是辛温解表药，温经通络，除痹止痛，又可走里，以温中健脾化湿。现代医学研究表明，桂枝的有效成分桂皮醛具有抗炎、抗肿瘤、解热镇痛、抗菌、降糖、抗肥胖等多种药理活性药理作用[13-16]。因此本研究选用桂枝作为研究对象。

通过预实验，发现桂皮醛在气相高效色谱的测定下十分敏锐。在气相测定中，升温速率与分流比对样品分离有重要作用，升温速率较大，分流比较小，使成分分离不彻底，分离度达不到标准；相反则会造成分离时间较长，浪费时间。因此本研究采用先慢后快的方式进行升温，在第一阶段以3℃/min的升温速率，使得桂皮醛与其他成分有效分离，后阶段以7 ℃/min的升温速率，尽快达到一定高温，以节省分析时间。

本研究提供一种含挥发油包合物的前期处理工艺及其相关参数，由于包合物中挥发油含量低，原来难以定量提出。使用该方法处理包合物，可以最大程度地提取得到挥发油，且工艺简单，易于控制，使后期测定更加准确可靠，利于实验研究。

本研究中针对有机溶剂的选择原则为沸点高低、水溶性大小以及毒性强弱。经了解，甲苯沸点为110.6℃，极微溶于水，但具有低毒性；甲酸乙酯虽无毒性，微溶于水，但沸点为53.4～54.4℃，较低；三氯甲烷有致癌可能性；乙酸乙酯沸点为77℃，温度较低；正丁醇沸点为117.7℃，虽稍溶于水，但无毒性；环己烷沸点为80.7℃，虽有低毒，但不溶于水；石油醚虽为混合物，但溶解度较好，沸点有90～120沸程，因此选用后三者有机溶剂为研究对象。

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（收稿日期：2017-09-28 本文编辑：王 琼）endprint