复合微生物制剂在鸡粪无害化处理中的应用研究

王国强，路文华，常 娟，尹清强*，刘超齐，王二柱，卢富山

（1.南阳农业职业学院，河南南阳473000；2. 河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；3. 河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453000；4. 河南普爱饲料股份有限公司，河南周口466000）

据报道，全国畜禽粪便年产量约为19亿t，是工业固体废弃物产量的2.4倍，加上污水年排放量高达60多亿t[1]，已成为我国最大的污染源。如果畜禽粪便得不到及时且合理的处理，会污染环境，孽生蚊蝇，病原菌种类增多，使病原菌和寄生虫大量繁殖，最终导致畜禽传染病和寄生虫病的发生，影响畜禽生产[2-4]。畜禽粪便的无害化处理主要有物理、化学与生物处理3种方法。物理处理方法存在处理过程耗时长和产生氨气等臭气及生产设备投资大、耗能高、排出的气体易造成二次污染等缺点[5-6]。化学方法因效果不稳定、易产生二次环境污染，使得该技术无法推广应用。生物方法不仅具有肥效高、成本低和效果好等特点，而且还具有灭菌与除臭的功效，是目前常用的一种较为合理的无害化处理方法[7]。周可等[8]试验表明，当采用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单孢菌混合菌剂，按0.2%接种时，鸡粪发酵温度上升快、腐熟快、病原菌数量降低明显。石星群[9]选用3株地衣芽孢杆菌和2株枯草芽孢杆菌等比例混合，按1%接种发酵鸡粪13 d后，鸡粪中的氨氮含量由1 241 mg/kg下降至335 mg/kg，其发酵结果要优于单一菌株发酵。由此可见，利用匹配良好的多种微生物发酵鸡粪的效果要优于品种少的微生物发酵，且配比合适将会发挥复合菌各自的发酵优势。但目前对于多种微生物在发酵粪便过程中协同作用的研究较少。本研究利用响应面回归旋转设计，探索多种微生物在处理畜禽粪便中的协同功效，为畜禽粪便的无害化处理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基 试验选用的干酪乳杆菌、产朊假丝酵母、粪肠球菌及枯草芽孢杆菌均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，并由河南农业大学动物营养与生物技术研究室保存。

培养枯草芽孢杆菌的LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。枯草芽孢杆菌经过LB固体培养基培养筛选纯化之后，接种至LB液体培养基进行扩大培养，培养条件为37℃、200 r/min，培养24 h，最后把所得的枯草芽孢杆菌有效活菌数调整为1.0×109CFU/mL。粪便中总菌数的测定也选用LB固态培养基，在37℃下培养48 h，其菌落形成数（CFU）用自然对数（lg）表示。

培养干酪乳杆菌和粪肠球菌的MRS液体培养基：胰蛋白胨15 g，酵母浸出物10 g，葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠2 g、柠檬酸铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。干酪乳杆菌和粪肠球菌分别经过MRS固体培养基培养筛选纯化之后，分别接种至MRS液体培养基进行扩大培养，培养条件为37℃、静置培养24 h，最后把所得的干酪乳杆菌和粪肠球菌的有效活菌数粪便调整为1.0×109CFU/mL。

培养产朊假丝酵母的YPD液体培养基：酵母浸出物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。产朊假丝酵母经过YPD固体培养基培养筛选纯化之后，接种至YPD液体培养基进行扩大培养，培养条件为28℃、200 r/min，培养24 h，最后把所得的产朊假丝酵母有效活菌数调整为1.0×109CFU/mL。

培养大肠杆菌的伊红美蓝培养基：（EMB，北京奥博星）：称取EMB 42.5 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用。培养条件为37℃、静置培养48 h。

1.2 单因素试验 枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、产朊假丝酵母和粪肠球菌皆进行单因素试验，分别按0、0.05%、0.1%、0.5%和1%接种（用相应培养基稀释到同等体积）。首先测定鸡排泄物中含水量为69.69%，采用250 mL锥形瓶，取样量为200 g，按上述比例接种微生物，在37℃培养箱中发酵120 h后取样测含水量、干物质、总活菌数、大肠杆菌数、pH、氮和吲哚含量等指标，每个处理3个重复。

1.3 相关指标及测定方法 含水量的测定采用GB/T6435-2014《饲料中水分的测定》；总活菌数的测定采用LB琼脂平板涂布法；大肠杆菌数的测定用伊红美蓝平板涂布法；pH检测采用pH S-2C酸度计（天津赛得利斯实验分析仪器）；氮含量测定采用GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》；鸡粪发酵温度的测定采用温度计测定。

吲哚含量的测定首先要准备吲哚乙酸（IAA）标准溶液(100 mg/mL)，并绘制标准曲线。称取样品10 g装入锥形瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液40 mL，于100℃水浴中煮沸15 min(上面加盖防止水分蒸干)，取出后再向其内加入0.1 mol/L NaOH溶液25 mL，充分摇匀，用甲醇定容至100 mL，静置30 min，取上清液在3000 r/min下离心30 min，上清液即为样品提取液。取试管3支，依次各加入上述样品提取液2 mL和试剂A（0.5 mol/L FeCl3溶液15 mL、浓H2SO4（比重1.84）300 mL，蒸馏水500 mL，于使用前混合均匀，避光保存）8 mL，于40℃温箱中显色30 min，在530 nm下比色（以双蒸水调零），记录OD值。

样品中吲哚含量（mg/g）=（A×V1)/（W×V2）式中，A为标准曲线上查得的IAA的量（mg），V1为样品提取液体积（mL），W为样品重量（g），V2为样品反应液体积（mL）。

1.4 复合菌的响应面设计 根据单因素的试验结果，选择干酪乳杆菌0.05%、产朊假丝酵母0.1%、粪肠球菌0.05%、枯草芽孢杆菌0.05%，分别作为4种菌的中心水平（设定为0水平），采用响应面设计软件进行设计（1、0、-1），以获得4种菌的最优组合。微生物发酵等操作流程与单因素试验设计相同。

1.5 统计分析 试验所得数据采用SPSS 20软件进行ANOVA方差分析，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著。通过Design-expert方差分析来验证回归模型及各参数的差异显著度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果 动物排泄物理想的微生物发酵状态应体现在低接种量，以及发酵终产物中含有较低的活菌数、大肠杆菌数、干物质损失率和吲哚含量，较高的发酵温度和氮含量。本研究以吲哚含量和接种量作为2个重要考核指标确定各菌剂的适宜添加量。从表1可以看出，干酪乳杆菌单因素指标中，温度、氮含量、总活菌数、大肠杆菌数、干物质损失率和吲哚含量在对照组和各试验组差异显著（P＜0.05）。干酪乳杆菌添加量为0.05%较为合适。

由表2可知，产朊假丝酵母添加量为0.1%时，温度最高、吲哚含量和总菌数最低（P＜0.05），添加量为0.5%时大肠杆菌数和干物质损失率最低（P＜0.05）。产朊假丝酵母添加量为0.1%较为合适。

从表3可以看出，粪肠球菌添加量在0.05%时温度最高、干物质损失率最低，而且吲哚含量和大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05）。因而，粪肠球菌的适宜添加量为0.05%。另外，随着粪肠球菌添加量的提高，相关指标有不同的改善。

由表4可知，当枯草芽孢杆菌添加量在0.05%时，吲哚含量、干物质损失率和总菌数显著降低（P＜0.05）。枯草芽孢杆菌的适宜添加量为0.05%。

2.2 最优复合菌的响应面回归设计

2.2.1 回归方程的建立及复合益生菌最佳配比的确定综合考虑单因素试验的结果，将0.05%干酪乳杆菌、0.05%粪肠球菌、0.10%产朊假丝酵母和0.05%枯草芽孢杆菌，分别设定为A、B、C、D 4个因素的零水平，进行响应面回归设计。试验因素水平编码（1、0、-1）和结果见表5，把吲哚含量作为响应值Y。得到回归方程：

通过对回归方程求最佳解，得到4种菌的最佳配比，即干酪乳杆菌0.06%、粪肠球菌0.07%、产朊假丝酵母0.15%、枯草芽孢杆菌0.07%，此时的吲哚含量最低。通过对响应面回归方程系数的方差分析结果可知，模型Prob＞F值小于0.01，表明该模型可信度高。

表1 干酪乳杆菌发酵鸡粪的单因素试验

表2 产朊假丝酵母菌发酵鸡粪的单因素试验

表3 粪肠球菌发酵鸡粪的单因素试验

2.2.2 复合微生态制剂对鸡粪的发酵结果 从表6可知，利用最佳配比的复合益生菌发酵鸡粪，使鸡粪中的吲哚含量、大肠杆菌数量和pH分别比对照组降低了87.50%、21.93%和16.72%（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢杆菌发酵鸡粪的单因素试验

表5 响应面回归设计与试验结果

表6 复合微生物制剂发酵鸡粪中pH、吲哚含量和大肠杆菌数量的变化(n=6)

3 讨 论

大量研究发现，畜禽粪便微生物发酵是最有效的无害化处理和资源化利用方法[10]。关于单一微生物发酵畜禽粪便的研究，Anderson等[11]研究发现，利用干酪乳杆菌对粪便进行发酵可显著降低大肠杆菌数量；杨恕玲等[12]研究发现，酵母菌和乳酸菌皆可提高鸡粪发酵温度，显著降低大肠杆菌数量和臭味；胡佩[13]用细黄链霉菌在30℃处理鸡粪，臭味物质浓度比对照组降低70%；姚军虎等[14]运用加藤菌发酵鸡粪便，取得了较好的效果。本研究结果表明，单一的乳酸杆菌发酵鸡粪的效果最佳，可显著降低吲哚和大肠杆菌含量，并提高发酵温度；其他3种菌的发酵效果依次为枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和粪肠球菌，与前人结果一致。微生物发酵动物粪便可降低臭味，主要是由于微生物对吲哚等臭味物质的分解作用及合成的抑制作用。微生物发酵过程中所产生的细菌素和发酵热可能是降低大肠杆菌数量的主要原因。

利用复合微生物发酵畜禽粪便的效果要优于单一菌种[8,15-18]，这主要是由于微生物之间存在着良好的协同关系。每一种微生物皆具有各自独特的繁殖特性和发酵功能。例如，乳酸杆菌和粪肠球菌属于兼性厌氧菌，可产生大量的酸性物质和细菌素，可以竞争性地排斥或抑制粪便中大肠杆菌等病原菌的繁殖，起到降低臭味和杀灭病原菌的作用；酵母菌属于需氧菌，有利于蛋白质类物质的合理转化，减少蛋白质向氨（胺）转化，降低臭味物质的合成；枯草芽孢杆菌属于需氧菌，可产生大量的发酵热，有利于杀灭大量的病原菌。本研究结果表明，当干酪乳杆菌、产朊假丝酵母、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌分别以0.06%、0.15%、0.07%、0.07%的接种量来发酵鸡粪时，可使粪便中吲哚和大肠杆菌含量及pH得到大幅度降低，取得了比较满意的效果。此外，利用复合微生物发酵畜禽粪便可生产出高品质有机肥，达到减少环境污染及合理利用资源目的[19-20]。本研究为畜禽粪便的无害化处理提供了一种新的复合微生物发酵剂。

4 结 论

本研究通过单因素及多因素响应面回归设计，得到了畜禽粪便无害化处理的复合微生态制剂的配比为：干酪乳杆菌0.06%、产朊假丝酵母0.15%、粪肠球菌0.07%、枯草芽孢杆菌0.07%。通过微生物发酵使畜禽粪便中的臭味和有害微生物含量大幅度降低，对于消除养殖业对环境的污染具有重要意义。

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