基于Miseq测序初步分析兴安落叶林外生菌根菌的生态分布

乌仁陶格斯，王 娟

（呼和浩特民族学院 环境工程系，内蒙古 呼和浩特 010051）

外生菌根是真菌的菌丝包被在植物幼嫩细根外形成的菌套和在细胞间形成哈帝氏网结构与宿主植物细根形成的共生体[1-3].Miller（1982）统计结果显示，世界上能形成外生菌根的真菌有约5000种[4].我国已经报道的外生菌根菌约520种，隶属于子囊菌和担子菌2个亚门，41科77属[5].外生菌根是在北方森林乔木树种菌根中的主要类型，在森林生态系统中起着非常重要的作用[6].

兴安落叶松（Larix gmelinii）是寒温带森林主要建群种，也是重要的用材针叶树种.内蒙古大兴安岭林区是我国最重要的国有林区之一，同时是我国北疆重要生态屏障.为加快改善森林生态环境，前人对大兴安岭森林植被与生物多样性保护方面做了大量的工作，尤其是在外生菌根菌资源调查、生态功能研究方面取得了一定的成果[7].研究表明，落叶松林下土生大型真菌中外生菌根真菌占94.45%[8].樊永军（2009）报道了与兴安落叶松共生的外生菌根菌14种[9].本文运用Illumina MiSeq测序平台，以大兴安岭落叶松为研究对象，初步调查分析大兴安岭兴安落叶松外生菌根菌生态分布，为外生菌根菌生态分布与环境因子的互作规律研究提供参考.

1 研究区概况

内蒙古大兴安岭国家级森林生态系统定位研究站位于内蒙古大兴安岭北部根河林业局境内，地理坐标为东经121°30′～121°31′，北纬 50°49′～50°51′，海拔 800m～1100m.该区属寒温带湿润气候区.主要森林植被有兴安落叶松（Larix gmelinii）为主，伴生种有白桦、山杨、杜鹃等.土壤类型为灰棕壤.

2 研究方法

2.1 样品采集与处理

于2015年8月，在内蒙古大兴安岭国家级森林生态系统定位研究站兴安落叶松林地，在试验区内选定的5个样地、每个样地设3个采样点，采集根际0cm～30cm深的土壤样品，分别取10cm×10cm×10cm带细根土样装入塑料袋中并编号，密封，并认真填写好野外调查表（包括海拔、经纬度等）.将土样带回实验室，置于-20℃冰箱中保存.将每个样地3个采样点的土样进行混合，此混合土壤样品作为DNA提取的样品，分别编号为 TX1、TX2、TX3、TX4、TX5.

2.2 实验方法

土样总DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA（具体DNA提取步骤按照说明书进行）.

基因组的PCR：

选用引物 真菌ITS检测扩增引物ITS1和ITS4

PCR 反应体系 5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，Forward Primer(5μmol/L)0.8μL，Reverse Primer(5μmol/L)0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng；补ddH2O至 20μL.

PCR反应程序 预变性95℃ 2min；循环95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，30 个循环；72℃延伸 5min.

PCR实验鉴定 用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，取2μL上样量进行检测.

测序与数据处理 将PCR产物利用Ilumina Miseq PE250进行测序.然后根据测序结果，整理、过滤原始数据，获取优质序列，并进行对比和统计分析.

3 结果与分析

鉴定结果表明，兴安落叶松采样地外生菌根菌分属于担子菌门Basidiomycota和子囊菌门Ascomycota 2个门，伞菌纲Agaricomycetes、节担菌纲Wallemiomycetes、盘菌纲Pezizomycetes、圆盘菌纲Orbiliomycetes 4个纲，革菌目Thelephorales、伞菌目 Agaricales、牛肝菌 Boletales、蜡壳耳目Sebacinales、红菇目 Russulales、阿太菌目 Atheliales、盘菌目Pezizales、圆盘菌目Orbiliales 8个目.其中伞菌目最多，优势菌目依次为伞菌目Agaricales、红菇目Russulales、牛肝菌Boletales. 在科水平上，Thelephoraceae、Sebacinaceae、Pyronemataceae、Inocybaceae、Suillaceae、Cortinariaceae、Russulaceae、Atheliaceae分别占所选真菌总数的8.14%、5.17%、2.86%、2.73%、1.38%、1.03%、0.72%、0.55%（详见表1）.

从兴安落叶松5个样地所采的土壤样品测试分析结果来看（如表1和表2所示），优势菌属主要为锦革菌属Tomentella、丝膜菌属 Cortinarius、红菇属 Russula、乳菇属（Lactarius）、乳牛肝菌属 Suillus.在每个采样地（TX1、TX2、TX3、TX4和TX5）出现的外生菌根菌种数依次为34、32、28、26和39种，其中每个样地均出现的外生菌根菌种有6种，如Russula versicolor、Russula citrinochlora、Lactarius vietus、Suillus paluster、Suillus spectabilis、Pseudotomentella tristis，TX5样地出现的菌种最多.

表1 所采样样地兴安落叶松主要外生菌根真菌科属水平统计

表2 鉴定到种的兴安落叶松外生菌根菌组成分析

续表

4 结论与讨论

本文采用Illumina MiSeq测序技术，对兴安落叶松外生菌根真菌进行了较全面的检测.从结果分析可知，兴安落叶松外生菌根菌类型较多，鉴定到2个门、4个纲、8个目.在科水平上，革菌科、蜡壳耳科、火丝菌科、丝盖伞科、乳牛肝菌科、丝膜菌科、红菇科所占比例较高.其中鉴定到种的共有53类型，如丝膜菌属21种、红菇属13种、乳牛肝菌属5种、棉革菌属4种、乳菇属4种、丝盖伞属3种、拟棉革菌属1种、蜡壳耳目属1种、地孔菌属1种.从菌根共生关系来看，这些多种类型的外生菌根菌能够帮助落叶松的生长及发育，提高它对不利环境的适应能力.

研究表明，在森林砍伐区内地上和地下部分的不同外生菌根菌丰度有所区别[10].外生菌根真菌的分布与温湿度林下光照、林龄以及抚育间伐等环境干扰因子有关[11].目前，外生菌根真菌分布的调查方法多样，选择不同的调查方法可能会影响研究结果.本研究利用Illumina Miseq测序平台，18SrRNA基因扩增子技术成功地检测了兴安落叶松真菌多样性，通过统计分析获得了大量的、较全面的外生菌根真菌信息.本次调查发现，在兴安落叶松不同样地土壤样品中的出现的外生菌根菌种类型各不相同，且外生菌根菌鉴定结果与樊永军（2009）[9]研究结果有所差异.说明，兴安落叶松林下外生菌根真菌分布较广，在维持生态系统稳定性中起到非常重要的作用，但由于所采用的调查方法、调查时间、选择样地的不同或环境干扰因子的影响等多种原因，引起其在土壤样品中存在种类、数量的差异.

〔1〕James M,Trappe.A.B.Frank and mycorrhizae：the challenge to evolutionary and ecologic tueory[J].Mycorrhiza,2004,15(14)：277～281.

〔2〕刘润进,陈应龙编著.菌根学[M].北京：科学出版社,2007.

〔3〕乌仁陶格斯,韩胜利,闫伟.浅析土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)自然侵染率与植被、根际土壤因子的关系[J].中国农学通报,2012,28(25)：47～51.

〔4〕弓明钦,陈应龙,仲崇禄.菌根研究及应用[M].北京：中国林业出版社,1997.

〔5〕冯云利,桑兰,吴素蕊,等.外生菌根菌研究概况[J].中国食用菌,2013,32(6)：1～3.

〔6〕Pierre-Emmanuel C,Marc B,Abdala G D,et al.The role of ectomycorrhizal communities in forest ecosystem processes：New perspectives and emerging concepts[J].Soil Biology&Biochemistry,2010,42：679～698.

〔7〕韩胜利,张秋良,安慧君,等.兴安落叶松天然林空间结构特征分析[J].干旱区资源与环境,2015,29(5)：87～92.

〔8〕祁亮亮.东北地区落叶松林下大型真菌多样性研究[D].东北师范大学，2016.3.

〔9〕樊永军.内蒙古地区四种树木外生菌根形态多样性及分子鉴定[D].内蒙古农业大学，2009.4.

〔10〕Byrd KB,Parker VT,Vogler D et al.The influence of clear-cutting on ectomycorrhizal fungus diversity in a lodgepole pine(Pinus contorta)stand,Yellowstone National Park,Wyoming,and Gallatin National Forest,Montana[J].Canadian Journal of Botany,2000,78(2)：149-156.

〔11〕陈晓,白淑兰,刘勇,等.抚育间伐对油松人工林下大型真菌的影响[J].生态学报,2013,33(21)：6935～6943.