微生物发酵制备富含共轭亚油酸酸豆乳的研究

高辉，李盟，朱振元，宋巧英，邱靖一，王艺臻，刘婷婷

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid简称CLA）是含有共轭双键的十八碳二烯酸的总称，是一种具有许多生理活性的天然脂肪酸，是亚油酸（Linoleic acid，18：2 n-6）的几何异构体，其中每个双键可为顺式或反式构型。因其在18碳脂肪酸的碳链上的不同位置，至少包括了28种异构体，最常见的、最具有生理活性的异构体是c9，t11-CLA和t10，c12-CLA[1-4]。研究发现共轭亚油酸与亚油酸在空间结构、理化性质以及生理功能等方面都具有显著差异，共轭亚油酸经肠粘膜吸收渗入到血脂、细胞膜及脂肪组织，或者经过代谢进一步合成一系列活性物质而发挥重要的生理功能[5]。此外，共轭亚油酸可以提高人体的免疫力，降低人体内脂肪含量，同时对抗癌，抗动脉粥样硬化，预防糖尿病以及改善骨组织代谢有重要的生理意义[6-8]。更有对实验老鼠进行研究，发现能减少致癌物引起的皮肤癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌和胸腺癌[9-11]。

随着人类对保健食品的大量需求，共轭亚油酸的需求量也就逐渐增大。目前关于CLA的合成方法很多，其中主要包括生物合成法和化学合成法[12-13]。近年来，也有人研究利用超临界流体的方法来萃取CLA[14]。化学合成法多采用碱异构法，转化率一般较高，但合成产物异构体组成十分复杂，产物分离纯化步骤较多，成本较高[15]。生物合成法是采用特定的酶或微生物催化相应的底物得到CLA，其中微生物合成法较为常用，许多微生物能够通过发酵形成一种能够合成CLA的酶[14]。目前常用生产CLA的有乳酸杆菌、丁酸弧菌、瘤胃菌、丙酸杆菌、真杆菌属等[16-17]。

乳酸杆菌产CLA的能力近年来也已得到相当广泛报道，基本涵盖乳酸杆菌各个种属。Lin[18]等研究表明，脱脂乳中亚油酸可被嗜酸乳杆菌（Lb.acidophilus）转化为CLA。Kishino等[19]报道了一批微生物可将亚油酸转化至共轭亚油酸，其中的一株植物乳杆菌（Lb.plantarum）可将高达85%的亚油酸转化为c9，t11-CLA和t9，t11-CLA，同时发现这株植物乳杆菌AKU1009a甚至可直接利用蓖麻油酸和蓖麻油产CLA。

豆浆亚油酸含量高达51.7%～57%[20]。本试验使用植物乳杆菌发酵豆浆制品，生产出富含共轭亚油酸的功能型固态酸豆乳。分别从豆浆的制备工艺条件优化以及植物乳杆菌产共轭亚油酸的最佳发酵条件的优化，不仅提高了豆浆中肠道有益菌的数量和豆浆蛋白质含量，也最大程度上完善了共轭亚油酸的生产。因此，本试验对促进富含共轭亚油酸固态发酵豆乳制品的开发具有一定的研究价值和广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆：市售散称；脱脂奶粉：光明乳业股份有限公司；蔗糖、琼脂：均为食品级市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：由天津科技大学生物资源与功能食品实验室提供。

共轭亚油酸标准品：美国NU-CHEK公司；正己烷、氯仿、无水硫酸钠、甲醇：天津江天化工技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Pico&Fresco台式离心机：Heraeus美国科俊仪器有限公司；LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；VS-1300L-U超净工作台：苏净集团安泰公司；UV-29200型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司。

1.3 培养基

1.3.1 乳培养基

脱脂奶粉12g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min。

1.3.2 复壮培养基

MRS培养基：1.0%牛肉膏，1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，2.0%葡萄糖，0.1%吐温-80，0.2%K2HPO4，0.5%乙酸钠，0.2%柠檬酸二铵，0.02%MgSO4·7H2O 和 0.005%MnSO4·H2O（pH6.5），固体培养基加琼脂1.8%～2.0%。121℃灭菌30 min。

1.3.3 菌种驯化培养基

逐渐减少脱脂还原乳比例，提高豆浆的比例，115℃灭菌15 min，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 豆浆的制备工艺

称100 g黄豆→加水浸泡→加一定量的水用匀浆机打制→过滤除去豆渣→加热煮沸

1.4.2 豆浆中粗蛋白含量测定

对豆浆粗蛋白含量测定，检测方法按照凯氏定氮法[21]。

1.4.3 豆浆制备单因素试验

1.4.3.1 浸泡时间对豆浆蛋白质含量的影响

分别设置 4、8、12、15、18、20、22 h 7 组试验，在水豆比10∶1（mL/g）的情况下制浆，然后测定豆浆蛋白质含量。

1.4.3.2 水豆比例对豆浆蛋白质含量的影响

分别设置不同水豆比 10 ∶1、11 ∶1、12 ∶1、13 ∶1、14∶1（mL/g）5组试验，在泡豆时间15 h条件下制浆，然后测定豆浆蛋白质含量。

1.4.3.3 加热时间对豆浆蛋白质含量的影响

在水豆比10∶1（mL/g）、泡豆时间15 h的条件下。首先在豆浆加热前取一次样，然后加热，当豆浆沸腾开始计时，分别于沸腾后3、5、8、10 min时取一次样，然后再测定豆浆蛋白质含量。

1.4.4 豆浆制备正交试验的优化

根据以上单因素试验结果，考察泡豆时间、水豆比例以及加热沸腾时间，分别取不同的水平，设计L9（34）正交试验，确定豆浆制备的最佳工艺条件。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

1.4.5 菌种活化与驯化

1.4.5.1 菌种活化

在无菌条件下，将冷冻干燥的植物乳杆菌接种到灭菌后的乳培养基中，于37℃恒温培养箱中培养至乳凝固，以5%的接种量继续接种到乳培养基2代～3代，使菌种恢复活力。

1.4.5.2 菌种驯化与保藏

菌种恢复活力后，以5%接种量按照以下豆浆比例培养基驯化：活化乳培养基→20%豆浆培养基→40%豆浆培养基→60%豆浆培养基→80%豆浆培养基→100%豆浆培养基，观察凝乳时间以及状态。每一个浓度梯度都传2代～3代，保证菌种在相应的浓度稳定传代。在驯化过程中，菌种会退化，这时需要用1.3.2复壮培养基进行复壮。对驯化后的菌种进行低温斜面保藏。

1.4.6 CLA标准曲线的测定

准确称取共轭亚油酸标准品10.0mg放入100mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，振荡使其充分溶解，此时共轭亚油酸标准液浓度为0.1 mg/mL，然后分 别 吸 取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL放入25 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成浓度分别为 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/mL的标准溶液，以正己烷为参比在233 nm处测定吸光度，以共轭亚油酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制共轭亚油酸标准曲线。

1.4.7 CLA的提取

本文使用氯仿-甲醇法提取共轭亚油酸。首先取1 mL发酵液于离心管中，在加入2 mL的氯仿：甲醇（2∶1，体积比），振荡均匀，于 4℃，5 000 r/min离心15 min，收集下层，加入一定量的无水硫酸钠干燥，然后在30℃真空浓缩，最后用正己烷定容至10 mL，混匀以备检测[22]。

1.4.8 CLA含量的测定

以正己烷为参比，在180 nm～290 nm紫外波长下进行扫描，读取233 nm处的吸光度。若吸光度不在标准曲线范围内，则再对样品进行稀释，然后再进行测定。

1.4.9 CLA生产的单因素试验

通过预试验分析以及为了提高发酵豆乳产品的品质，本文采用蔗糖作为甜味剂，琼脂作为稳定剂、乳化剂，以及发酵时间和接种量这4个因素为主要研究对象进行试验，以期为正交试验准备。发酵基础培养基为80%豆浆培养基。

1.4.9.1 发酵时间对CLA产量的影响

从驯化后的豆浆培养基以5%接种量接种到新的灭菌的豆浆基础培养基中，不添加蔗糖和琼脂，37 ℃下分别恒温培养 12、18、24、30、36、42、48 h，发酵结束后测定共轭亚油酸含量。

1.4.9.2 接种量对CLA产量的影响

从驯化后的豆浆培养基分别以1%、2%、3%、4%、5%接种量接种到新的灭菌的豆浆基础培养基中，不添加蔗糖和琼脂，37℃培养24 h至乳凝固后提取发酵液，用于测共轭亚油酸含量。

1.4.9.3 蔗糖添加量对CLA产量的影响

分别设置蔗糖添加量为1%、3%、5%、7%、9%5个水平，每个水平以5%的量进行接种，并且设置空白对照组，不添加琼脂，37℃培养24 h至乳凝固后提取发酵液，测定共轭亚油酸含量。

1.4.9.4 琼脂添加量对CLA产量的影响

分别设置琼脂添加量为0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%6个水平，每个水平以5%的量进行接种，并且设置空白对照组，不添加蔗糖，37℃培养24 h至乳凝固后，观察其凝乳的稳定状态并提取发酵液，测定共轭亚油酸含量。

1.4.10 培养条件的正交试验设计

根据以上单因素试验结果，考察发酵时间、接种量、蔗糖添加量以及琼脂添加量，分别取不同的水平，设计L9（34）正交试验，确定菌株产共轭亚油酸的最佳培养条件。

2 结果与讨论

2.1 豆浆制备条件的优化

2.1.1 浸泡时间的优化

不同浸泡时间豆浆蛋白含量见图1。

表2 正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

图1 不同浸泡时间豆浆蛋白含量Fig.1 Protein content of soymilk with different immersion

从图1可以看出，随着浸泡时间的增加豆浆蛋白质含量增加，这是由于黄豆经过浸泡后，蛋白质更容易溶出，但是当浸泡时间超过15 h后，豆浆蛋白质含量下降，可能是因为浸泡时间太长，黄豆浸泡液中有大量的白色乳液，这可能是蛋白质流失到浸泡液中。综合考虑，本试验采用8、12、15 h为浸泡时间的3个水平。

2.1.2 水豆比例条件的优化

不同水豆比例下豆浆蛋白含量见图2。

图2 不同水豆比例下豆浆蛋白含量Fig.2 Protein content of soymilk with different weight rations of water and beans

由图2可知，随着水豆比例的增加，豆浆逐渐被稀释，豆浆中蛋白质的浓度也逐渐降低，为了提高豆浆的营养价值，经综合考虑选用10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）为水豆比例的3个水平。

2.1.3 加热时间条件优化

不同加热时间下豆浆蛋白含量见图3。

图3 不同加热时间下豆浆蛋白含量Fig.3 Protein content of soymilk with different heating time

由图3可知，随着加热时间的增加，豆浆溶液逐渐被浓缩，豆浆中蛋白质含量逐渐升高，但是当加热时间超过8 min时，豆浆会出现糊味并且蛋白质在豆浆表面凝聚成一层厚厚的膜，使豆浆口感和颜色都欠佳。因此本试验选用3、5、8 min为加热时间的3个水平。

2.1.4 豆浆制备条件的正交试验

正交试验结果见表3。由表3极差分析可知，各因素的主次顺序为B（水豆比例）＞C（加热时间）＞A（泡豆时间）。通过单因素和正交试验，确定豆浆制备的最佳条件为A3B1C3，即泡豆时间15 h，水豆比例10∶1（mL/g），加热时间 8 min。豆浆蛋白质含量在此条件下为3.96%。

表3 L9（34）正交试验结果Table 3The results of orthogonal experiment of L9（34）

2.2 菌种的驯化以及基础培养基的选择

通过对植物乳杆菌在不同豆浆浓度的培养基进行培养转接，通过观察凝乳时间以及生长特性，研究发现植物乳杆菌可以在100%豆浆培养基中较好的生长，而且具有稳定传代的性状。为了提高豆浆的营养价值，本试验选用80%的豆浆培养基作为后续试验的基础培养基，并且对该浓度下驯化的菌种进行低温斜面保藏，每次使用前都需要进行活化2次～3次后使用。

2.3 CLA标准曲线的绘制

CLA标准曲线见图4。

图4 CLA标准曲线Fig.4 Standard curve of CLA

由图4可得到共轭亚油酸标准曲线，其线性回归为Y=0.0739x+0.0314，其中Y代表233nm处的吸光度，x代表待测样品共轭亚油酸浓度，R2=0.997 4说明回归拟合效果较好。

2.4 菌株产共轭亚油酸条件的优化

2.4.1 发酵时间条件的优化

发酵时间对CLA产量的影响见图5。

图5 发酵时间对CLA产量的影响Fig.5 Effect of fermentation time on CLA production

由图5可得CLA产量随着发酵时间的变化，在一定时间内，随着时间的增加植物乳杆菌不断生长繁殖，使亚油酸异构酶含量也增加，但是当时间超过36 h时，CLA产量逐渐降低，可能是随着时间的延长乳酸菌产酸量增多导致培养基内pH值下降从而抑制了亚油酸异构酶活性。因此选用发酵时间24、30、36 h 3 个水平。

2.4.2 接种量条件的优化

接种量对CLA产量的影响见图6。

图6 接种量对CLA产量的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on CLA production

由图6可得，随着接种量的增加，培养基内乳酸菌繁殖更加旺盛，CLA产量也随之增加。但是当接种量超过3%时，可能因为培养基内营养物质有限使菌种竞争性抑制加强导致菌种衰退甚至死亡，使CLA产量下降。本试验选用2%、3%、4%为接种量3个水平。

2.4.3 蔗糖添加量条件的优化

蔗糖添加量对CLA产量的影响见图7。

图7 蔗糖添加量对CLA产量的影响Fig.7 Effect of sucrose content on CLA production

由图7可得，随着蔗糖添加量的增加，为植物乳杆菌生长提供了更多的碳源，CLA产量也逐渐增加。当添加量超过7%时，CLA产量逐渐降低，原因可能是高糖溶液使乳酸菌细胞处于高渗溶液从某种程度上抑制了乳酸菌的生长，且有文献表明一定浓度的蔗糖溶液对CLA的生成有一定的抑制作用[23-26]。综合考虑，本试验选用6%、7%、8%为蔗糖添加量3个水平。

2.4.4 琼脂添加量条件的优化

琼脂添加量对CLA产量的影响见图8。

由图8可得，琼脂添加量对CLA产量无较明显的影响，但是当琼脂添加量超过0.8%时，CLA产量显著下降而且在培养基的溶解性以及凝乳效果都较差，可能是由于琼脂量较多在某种程度上为植物乳杆菌的生长提供了阻力。因此，本试验选用0.6%、0.7%、0.8%为琼脂添加量的3个水平。

图8 琼脂添加量对CLA产量的影响Fig.8 Effect of agar content on CLA production

2.4.5 培养条件优化的正交试验设计

正交试验结果见表4。由表4极差分析可知，各因素的主次顺序为B（接种量）＞A（发酵时间）＞C（蔗糖添加量）＞D（琼脂添加量）。通过单因素和正交试验K值推断出最优结果为A3B3C1D3，然后再与编号6条件下所制得酸豆乳的共轭亚油酸产量进行验证试验，在A3B3C1D3条件下测得共轭亚油酸含量为29.68 μg/mL，此含量低于编号6条件下的共轭亚油酸产量，因此确定培养条件的最佳水平为A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%、琼脂添加量0.7%、接种量4%、培养时间30 h，其共轭亚油酸产量为29.83 μg/mL。

表4 L9（34）正交试验结果Table 4The results of orthogonal experiment of L9（34）

3 结论

本试验首先从单因素和正交试验确定了豆浆制备的最佳工艺流程为：泡豆15h、水豆比例10∶1（mL/g）、加热沸腾时间8 min，在此条件下，豆浆中蛋白质含量为3.96%。由于植物乳杆菌不能直接在豆浆培养基中生长，因此本文对乳酸菌在不同比例的豆浆培养基中进行驯化，最终选择80%豆浆培养基为后续基础发酵培养基。通过单因素和正交试验确定菌株产CLA的最佳发酵条件为：蔗糖添加量6%、琼脂添加量0.7%、接种量4%、培养时间30 h，在此条件下，最终得到的CLA产量为29.83 μg/mL。

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