猪流行性腹泻病毒与猪流行性腹泻

包小萌 （山东省海阳市动物疫病预防与控制中心 265100）张金勇 （新希望六和动保中心 山东 青岛）



猪流行性腹泻病毒与猪流行性腹泻

包小萌 （山东省海阳市动物疫病预防与控制中心 265100）张金勇 （新希望六和动保中心 山东 青岛）

猪流行腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)为尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronaviridae)成员，可造成新生仔猪的急性腹泻、呕吐、脱水等临床症状并使新生仔猪呈现高死亡率；该病毒可引起育肥猪以及成年母猪腹泻或是隐性感染。PEDV首先在欧洲发现并报道，并迅速蔓延至亚洲，2013年美国暴发猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)，随后加拿大、墨西哥等美洲国家相继发现PEDV。猪流行性腹泻发现以来，给流行区域的养猪产业造成了严重的经济损失。本文章拟综述PEDV的病原学特征、流行、诊断以及防治，以期对猪流行性腹泻的防治提供依据。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种传染病，猪腹泻是该病的主要症状，除此之外，仔猪会呈现呕吐、厌食、脱水以及体重减轻等其它的临床症状[1]。PEDV可感染各个年龄段的猪群，并表现不同的临床症状；感染PEDV的仔猪经常由于水样腹泻以及脱水而死亡，死亡率可高达80%~100%[2]。PED首次于1971年在英国发现并报道，1982年该病在亚洲国家首次报道并给养猪行业造成了巨大的经济损失，2013年美国确认了存在PED的流行并迅速传播至加拿大、墨西哥等美洲国家[3]。猪流行性腹泻的迅速传播，已经成为世界各国养猪行业的潜在威胁，因此研究该病的病原学特征、流行特点、诊断方法以及有效的防治方法迫在眉睫。

1 猪流行性腹泻病毒病原学特征

（1）PEDV为尼多病毒目冠状病毒科成员，冠状病毒科包括冠状病毒属、隆病毒属。其中，冠状病毒属包括猪流行性腹泻病毒、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)以及人呼吸道冠状病毒等十余种病原；隆病毒属目前仅有伯尔尼病毒、布里达病毒以及人类隆病毒等[4]。（2）PEDV为单股正链RNA病毒，呈现球形，直径约95~190nm；有囊膜，囊膜表面有12~ 24nm纤突，纤突末端呈球状，并且纤突有规则的排列为皇冠状(附图所示)。该病毒基因组全长约为28kb，包含一个5’帽子结构、3’腺苷酸尾巴结构，并由5’非编码区，至少7个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2~6)以及3’非编码区组成[5]；其中，ORF1a、ORF1b编码病毒聚合酶，ORF3编码结构蛋白并且认为该区域与病毒的致病性相关[6]；其他的开放阅读编码S，E，M，N蛋白[7, 8]。PEDV的蔗糖密度为1.18g/ml，对乙醚和氯仿敏感；该病毒在4~50℃和pH值为4~9范围内可稳定存在；酸性或碱性消毒剂均可使该病毒失活[9]。（3）冠状病毒可以侵蚀呼吸道以及肠道的上皮细胞、巨噬细胞，PEDV可侵入猪小肠绒毛上皮细胞并在其中复制[10]。现已证实，猪氨基肽酶N(Porcine aminopeptidase N，pAPN)为小肠绒毛上皮细胞上PEDV的细胞受体。PEDV结合细胞上的pAPN并通过膜融合的方式将病毒的基因组释放至细胞质内，病毒基因组在细胞内进行复制、修饰、翻译以及组装成新的病毒粒子，病毒粒子经胞吐的方式释放至细胞外[3]。

附图 PEDV结构示意图[3]

2 猪流行性腹泻的近期流行状况

（1）20世纪70年代，PED首次于英国报道，该病迅速蔓延至欧洲各国；在20世纪80~90年代，PED频繁暴发，并且仅在断奶仔猪以及育肥猪体现出腹泻的临床症状[11]。2005~2006年，在欧洲多个牧场可检测到PEDV；而在2006年年中以及2007年年末，PEDV阳性养殖场的PED病例逐步消失；2007~2014年，PED仅在PEDV阳性场的各个年龄段的猪群呈现一过性感染，并且死亡率较低[12]。（2）在亚洲，日本于1982年首次报道PED流行，该病迅速传播至毗邻各国如中国、韩国等国家；随后在各国不断发生流行，在20世纪90年代，仔猪的死亡率由30%上升至100%；在21世纪初，该病传播至菲律宾、泰国、中国台湾等国家和地区，并给当地的养猪产业造成了巨大的经济损失[13]。2010年，在中国的部分省份出现了PED的大规模流行，并向西北地区的省份进行蔓延；截至目前为止，中国至少含有29个省份存在PED的流行；2013年10月份，日本时隔7年再一次暴发PED，日本研究机构分离出毒株并与已发表的毒株比较，发现该株病毒与美国和中国2013年暴发的毒株同源性极高[14]。2013年末，在韩国以及中国台湾地区也有相关PED暴发的报道[15]。（3）2013年4月，在美国的爱荷华州暴发PED，后经研究人员分析，该病的病原与中国2011~2012年的一株病毒(China/2012/AH2012)同源性极高；该病迅速向其他州蔓延传播，截止2014年9月份，已在包括爱荷华州、俄亥俄州、印第安纳州等32个州的猪场发现PEDV[16,17]。PED自美国发现，迅速传播至美洲其他国家，2013年7月，于墨西哥发现PEDV；2013年10月，秘鲁首次确认存在PEDV；2014年3月，古巴共和国发现PED病例；2014年4月，加拿大报道PED的流行；2014年9月，传播至多米尼加共和国等等[18]。

3 猪流行性腹泻的诊断

3.1 猪流行性病的临床特征 （1）PED最主要的临床症状为水样腹泻，所有日龄的猪均可感染发病，但是仔猪的发病率可高达100%。新生仔猪的小肠绒毛上皮细胞的更新时间为5~7d，1周龄以内的仔猪常常持续腹泻3~4d而脱水死亡，平均病死率为50%，有时可高达100%；日龄较大的仔猪在感染后的1周可恢复；育肥猪以及母猪可能会出现腹泻的症状，主要表现为厌食和精神沉郁[4]。疾病开始发生至疾病转归的时间通常为3~4周，但在比较大型的养殖场中暴发流行PED，可能持续的时间还会延长。（2）新生仔猪感染PED的临床症状包括：精神沉郁、被毛粗乱、呕吐腹泻、脱水等；由于脱水的发生，仔猪很快死亡。感染PED的仔猪经解剖肉眼观察，可见明显的病变。腹泻早期，小肠内可见大量的黄色液体并膨胀，肠系膜淋巴结肿大，小肠壁变薄；新生仔猪发生脱水时，于显微镜下观察，可见小肠上皮形成空泡，严重者小肠上皮可脱落，小肠绒毛萎缩至原来的2/3，并且肠道内酶活性显著下降[19]。

3.2 猪流行性腹泻的实验室诊断 （1）由于PED与传染性胃肠炎(TGE)的临床症状十分相似，临床上经常将二者混淆；随着技术的进步，可借助病毒分离、免疫组化、免疫荧光技术、分子生物学技术等实验室手段鉴定PEDV。（2）利用胰酶处理后的Vero细胞大大提高了分离PEDV的效率；而利用普通电镜法也无法将PEDV与TGEV区分，因此科研人员选择将PEDV与高免血清混合后离心，观察到PEDV病毒粒子呈晶格状排列[20]。（3）RT-PCR具有高明感性以及特异性，因此将其作为检测病原的常用手段，科研人员根据PEDV基因组设计巢式PCR[21]，可用于PED的诊断以及流行病学调查。随着技术的发展，修金生等利用荧光染料法(SYBR Green)建立起荧光定量PCR方法用以检测PEDV，结果显示，该方法灵敏度高、特异性好等优点[22]；张志等优化探针法(Taq-Man)建立起检测PEDV的方法，为PED的快速诊断提供有效手段[23]。（4）ELISA作为一种简便、灵敏的检测方法，可用于检测抗原以及抗体。随着技术的进一步发展，胶体金技术成为现场检测PEDV的一种快速、有效的方法；由张利勃等建立的检测PEDV的胶体金方法，为基层防疫检疫人员提供便利[24]。

4 猪流行性腹泻的预防和控制

4.1 流行性腹泻疫苗 （1）疫苗是防控病毒传播的最有效的手段，因此研究预防PED的有效疫苗刻不容缓。尽管欧洲最早流行PED，但是防控PED流行传播的疫苗却首先在亚洲研发成功。中国最早应用CV777减毒或灭活疫苗来预防PED；日本在Vero细胞上连续传代100多代后获得了83P-5株减毒活疫苗。目前，在中国国内主要以PED-RV-TGE三联活疫苗为主预防PED，但仍继续研发新型疫苗。（2）传统疫苗主要为灭活疫苗以及减毒活疫苗。研究人员采用组织灭活疫苗免疫猪，结果证明免疫效果显著，但是此种方法中灭活疫苗所产生的持久性保护效果不强，需多次免疫才可产生稳定持久性保护效果，不利于大群免疫。自1988年PEDV分离技术成熟以后，研究人员使用Vero细胞对PEDV进行培养；马思奇等利用Vero细胞培养CV777株PEDV而制备成PED灭活疫苗；徐宏军等在其基础上制备了转瓶工艺以及细胞悬浮培养工艺而制备CV777株PEDV灭活疫苗，经试验验证，该灭活苗免疫效果较组织灭活苗显著提高，可有效的防控PEDV的流行[25]。但由于PEDV发生变异，致使抗原表位发生改变，因此CV777株PEDV灭活疫苗防控PEDV野毒株的能力减弱，因此新型有效的灭活疫苗亟待研发。截止目前为止，临床上预防PEDV的疫苗为弱毒疫苗，其中以PED-RV-TGE三联苗为代表，用以PED的防控。（3）随着分子生物学技术的进步，研发高安全性以及有效性的基因工程疫苗已经成为一种趋势。赵德等将PEDV的有效抗原基因片段(S片段)插入乳酸菌载体，成功构建了乳酸菌载体疫苗，并通过动物试验验证了该载体疫苗适用于口服，免疫后可产生较高效价的抗体；项林盛等通过双酶切的方法将PEDV S1基因整合至重组腺病毒载体，包装出可稳定表达PEDV S1蛋白的重组腺病毒载体疫苗，为研制PED黏膜免疫疫苗奠定基础。研究人员利用原核表达系统或真核表达系统，表达出PEDV含有抗原表位蛋白，并将该蛋白免疫动物证实了蛋白具有免疫原性；但该方法成本较高，不适用于实际生产。以Suo为代表的科研人员利用Pvax1等载体构建出表达有效抗原的DNA疫苗，经动物试验验证，可产生较高水平的特异性抗体且血清可中和病毒[26]。

4.2 流行性腹泻的控制 加强饲养管理预防为PED流行的主要措施，发现感染PEDV的猪只尽早做隔离处理并进行严格的消毒；哺乳仔猪感染PED后让仔猪其自由饮水或人工补充水电解质，防止仔猪因脱水而死亡。由于PEDV的传播相对较慢，可采取相应的预防措施预防该病毒进入分娩舍，例如可将感染仔猪的带毒排泄物接触妊娠母猪，刺激妊娠母猪机体产生特异性免疫反应，此方法可推迟或减缓该病毒对仔猪产生感染或造成死亡，从而减轻经济损失。

5 小结

（1）在过去的20~30年中，PEDV已经给亚洲以及欧洲的养猪产业造成了巨大的经济损失。而2013年，PED传播至北美，迅速向美洲各国蔓延；PED已经成为世界范围内流行传播疾病，严重制约着养猪产业发展。（2）因此，必须要进一步研究PEDV的病原结构、流行趋势、诊断方法等，为研制预防该疾病的有效疫苗以及建立有效地生物安全措施提供依据。

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（2017–10–10）

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