IL-8诱导的肿瘤相关巨噬细胞对肝细胞肝癌侵袭转移的影响*

肖培 叶英楠 宁俊雅 于文文 刘芃芃 张蕊 刘婷 于津浦

原发性肝细胞肝癌是全球最常见、进展快、恶性程度高、愈后较差的实体肿瘤之一［1］。临床分型大多属于肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。尽管HCC的治疗取得了较大的进步，但其易发生远处转移，肝内散播和术后复发，使得HCC患者生存率低下，因此探索肝癌侵袭转移的分子机制，筛选新的靶向治疗位点，已成为提高肝癌疗效及改善预后的突破点。

肿瘤细胞非肿瘤组织中的唯一成分，肿瘤的形成与演变不仅与肿瘤细胞自身相关，还与肿瘤细胞赖以生存的微环境紧密相关。HCC是一种典型的炎症相关性肿瘤，慢性炎症的持续刺激与肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤的炎症微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是起主要作用的炎性细胞之一［2-3］，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［4］。但是HCC微环境中TAMs的来源及作用尚不明确。

本课题组前期研究发现，HCC组织中IL-8可以促进上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的发生，同时与局部分化抗原群68（cluster of differentiation 68，CD68）阳性TAMs的浸润明显相关［5］。IL-8是一种重要的中性粒细胞和单核细胞趋化因子，因此本研究推测TAMs在IL-8导致的EMT过程中发挥重要作用。本研究着重探讨外源性IL-8对TAMs的活化作用及活化后TAMs对HCC EMT和侵袭转移的影响，最后在HCC组织层面进行验证，以期为HCC的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集天津医科大学肿瘤医院肝胆肿瘤科从2007年11月至2009年11月经部分肝切除手术治疗的HCC患者100例。其中男性93例，女性7例，中位年龄为54（35～71）岁。经病理诊断均为HCC，术前未接受放化疗和靶向治疗等相关抗肿瘤治疗。其中，临床分期为Ⅰ期25例，Ⅱ期54例，Ⅲ期21例。本研究经天津医科大学肿瘤医院伦理委员会审查批准。

1.1.2 试剂 鼠抗人CD68单克隆抗体、通用型抗鼠/兔二步法检测试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。鼠抗人IL-8单克隆抗体购自美国abcam公司。兔抗人上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连接素（β-catenin）、N-cadherin、Snai、Slug单克隆抗体以及羊抗兔二抗均购自美国CST公司。Reparixin购自美国MCE公司。IL-8、IL-10和IL-12 ELISA检测试剂盒均购自中国达科为公司。人肝癌细胞系Hep3B、HepG2和THP-1细胞由本课题组保存，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养液DMEM和RPMI 1640及胎牛血清购自美国Gibco公司，Matrigel基质胶、Transwell培养板购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hep3B和HepG2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5%CO2条件下进行培养。THP-1细胞由含10%胎牛血清的1640培养液在37℃、5%CO2条件下进行培养。所有细胞在培养过程中均进行支原体检测。IL-8刺激THP-1细胞组和未刺激组分别与Hep3B和HepG2细胞共孵育。

1.2.2 免疫组织化学检测 将组织切片于60℃保温箱内烘烤2 h后，二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、PH=7.0的EDTA修复、3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，分别滴加鼠抗人CD68、IL-8及兔抗人N-cadherin、E-cadherin和β-catenin抗体，4℃孵育过夜。第2天滴加通用型抗鼠/兔二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素染核，盐酸酒精显红，氨水返蓝，酒精梯度脱水，二甲苯透明化处理，中性树胶封片，显微镜下观察。结果评定标准为：IL-8为HCC胞质内着色，N-cadherin和E-cadherin为HCC的胞膜着色，β-catenin为HCC的胞质和细胞膜着色，CD68为TAMs的胞质和胞质膜着色。每例标本在显微镜下随机选择10个400倍视野，每个视野计数100个细胞。采用双评分半定量法进行评价，细胞染色阳性率（positive rate，PR）按标本中着色的阳性细胞比例分为4级，具体评分标准如下：0分为PR≤10%，1分为PR的11%～30%，2分为PR的31%～60%，3分为PR＞60%。按标本的染色强度（staining intensity，SI）也分为4级：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。最后，将这两种评分相加，＜4分定义为低表达或不表达，≥4分定义为高表达。CD68阳性细胞计数：先在低100倍视野下观察整张切片，选择5个不重叠的200倍视野下分别计数CD68阳性的细胞。本研究定义5个不重叠的200倍视野下细胞总数＞40个为CD68阳性的TAMs高浸润组（TAMshigh），≤40个定义为TAMs低浸润组（TAMslow）。

1.2.3 ELISA 将试剂和细胞培养上清置于室温下平衡，按比例将标准品采用等比例稀释法进行稀释；加样：向对应孔中加入标准品或样品100 μL，室温孵育1 h；洗涤：倒净液体并拍干，加入Washing buffer洗涤液洗3遍；加抗体：将抗体按照1:50稀释后，每孔加入50 μL，室温孵育1 h；再次洗涤：倒净液体并拍干，加入washing buffer洗涤液洗三遍；加入HRP：将HRP按照1:100稀释后，每孔加入100 μL，室温孵育30 min；重复以上洗涤过程；显色：每孔加入TAB显色液100 μL，避光显色10～30 min；波长450 nm测OD值，根据OD值绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.2.4 流式细胞术 取对数生长期的THP-1细胞接种于6孔板中，每孔约3×105个细胞，铺板时细胞的融合率为60%左右，向细胞培养板中加入5 ng/mL IL-8，37℃、5%CO2培养48、72 h；然后，收集细胞于流式管中，加入1 mL PBS洗涤，1 000 rpm×5 min离心，然后弃上清；流式管中加入100 μL PBS制成细胞悬液，加入5 μL鼠抗人Percp CD68、APC CD206、PE CD163和兔抗人PE-cy7 CCR7抗体，阴性对照管不加，同时设同型对照管和单染管；轻轻混匀，4℃避光处孵育30 min；然后每管加入1 mL PBS洗涤抗体，1 500 rpm×5 min离心，弃上清；最后加入200 μL 1%多聚甲醛于流式管中进行细胞固定，上流式细胞仪进行结果检测。

1.2.5 划痕修复实验 取处于对数生长期的Hep3B和HepG2细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，铺板时细胞的融合率约为30%。37℃、5%CO2过夜培养，细胞融合率达到80%左右时，用20 μL枪头在每孔进行划痕，用PBS洗去划下的细胞，更换为无血清培养液，同时将体外诱导的TAMs和THP-1细胞按照与HCC细胞1:1的比例分别接种于0.40 μm的Transwell小室上室。继续放入37℃、5%CO2孵箱培养，每12 h于显微镜下观察，拍照，拍照时将Transwell小室取出。计算划痕修复率：24、48 h划痕修复率=（24、48 h划痕间距-0 h划痕间距）/0 h划痕间距。

1.2.6Transwell实验实验将20μLMatrigel（1mg/mL）铺于8 μm Transwell小室底部，37℃培养箱放置1 h，待Matrigel胶凝。在Transwell小室下室中分别加入含10%FBS的培养基、THP-1细胞和体外诱导的TAMs，500 μL/孔，上室孔中分别加入2×104个Hep3B和HepG2细胞，200 μL/孔，同时设立0.2 nmol/mL Reparixin处理Hep3B和HepG2细胞组，去血清培养48 h。THP-1的趋化实验在Transwell小室的底部不铺Matrigel，上室中加入3×104个THP-1细胞，下室中分别加入10%FBS，同时实验组加入5 ng/mL的IL-8，培养48 h，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，PBS洗后倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞，计数。

1.2.7 实时荧光定量PCR 取对数生长期的Hep3B和HepG2细胞以3×105个/孔接种于6孔板中，共分3个处理组：未处理组、Transwell法与THP-1细胞共孵育组和与IL-8刺激THP-1细胞共孵育组，37℃、5%CO2培养72 h。弃去Transwell小室，将上述不同处理的Hep3B和HepG2细胞用Trizol法提取总RNA，以此为模板行逆转录得cDNA。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail和Slug及内参β-actin的mRNA表达。按照下面的公式进行数据分析，相对表达量=2-ΔΔCt=2-［ΔCt（样品）-ΔCt（内参）］。所有实验独立重复3次。

1.2.8 Western blot检测 将Hep3B和HepG2细胞以3×105个/孔接种于6孔板中，共分3个处理组：未处理组、Transwell法与THP-1细胞共孵育组和与IL-8刺激THP-1细胞共孵育组，37℃、5%CO2培养72 h。弃去Transwell小室，RIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至PVDF膜上。5%BSA封闭1 h后，抗E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snai和Slug（1:1 000）及内参βactin（1:2 000）抗体4℃孵育过夜。TBST漂洗后，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:4 000）室温孵育1 h，TBST漂洗后，ECL显色曝光检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用Median表示，计数资料采用x±s表示，计量资料的比较采用χ2检验，计数资料的比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-8促进THP-1细胞向M2型TAMs转化

研究IL-8对单核细胞THP-1趋化作用的影响，发现IL-8对THP-1细胞具有明显的趋化作用［（87.33±4.333）vs.（185.0±3.606），P＜0.05，图1A］。以5 ng/mL IL-8刺激THP-1细胞48 h后，CD68阳性（CD68+）细胞的百分比增加（P＜0.05），同时CD163和CD206双阳性（CD163+CD206+）细胞的百分比也增多［（4.80%±0.72%）vs.（14.60%±2.59%），P＜0.05］，而CCR7阳性（CCR7+）细胞的百分比有降低的趋势，但是差异无统计学意义［（15.27%±1.378%）vs.（14.37%±2.521%），P＞0.05，图1B］。进一步的研究发现IL-8刺激THP-1细胞72 h后CD68+细胞的百分比增加（P＜0.05），同时CD163+CD206+细胞的百分比明显增多［（5.43%±0.87%）vs.（42.13%±0.88%），P＜0.05］，而CCR7+细胞的百分比降低［（10.77%±1.86%）vs.（0.63%±0.17%），P＜0.05，图1B］。这表明，IL-8可以诱导THP-1细胞的表型向M2型TAMs的方向转化。进一步的研究还发现，IL-8刺激THP-1细胞后上清液中IL-10的含量明显高于未处理组［（63.67±1.86）pg/mLvs.（33.30±3.78）pg/mL，P＜0.05］；而IL-12的分泌量却低于未处理组［（13.68±0.29）pg/mLvs.（19.31±1.43）pg/mL，P＜0.05，图1C］。因此，从细胞表型和因子释放两个方面，证明IL-8可促进THP-1细胞向M2型TAMs方向转化。

2.2 体外诱导TAMs与HCC细胞共孵育后可以促进HCC的EMT和侵袭转移

在进行划痕修复实验前，利用CCK8法检测Hep3B和HepG2细胞0、24、48 h的细胞增殖水平，发现不同处理组的细胞增殖率无差别。接下来研究IL-8活化的TAMs对HCC细胞EMT和侵袭转移的影响。Hep3B细胞和IL-8活化的THP-1共孵育24h和48h后（Hep3B+TAMs组，50.67%±3.48%和74.67%±3.18%）的划痕修复率显著高于Hep3B细胞和IL-8未处理的THP-1共孵育（Hep3B+THP-1组，26.33%±2.33%，P＜0.05；41.33%±1.86%，P＜0.05），或单独的Hep3B细胞（Hep3B组，19.67%±2.60%，P＜0.05；33.00%±2.08%，P＜0.05，图2A）。同样的，Hep3B+TAMs组Hep3B细胞侵袭的数目也显著高于Hep3B+THP-1组［（197.30±6.44）vs.（86.00±3.45），P＜0.05］和Hep3B组（72.33±5.04，P＜0.05，图2B）。因此，TAMs可以提高Hep3B细胞的迁移和侵袭能力。在TAMs与HepG2细胞共孵的实验中也发现TAMs可以促进HepG2细胞的迁移和侵袭能力（图2E～F）。

接下来进一步检测Hep3B、HepG2、THP-1细胞和活化后的TAMs分泌IL-8的水平，发现活化后的TAMs分泌IL-8的量明显高于THP-1、Hep3B和HepG2细胞［（654.70±16.70）pg/mLvs.（321.70±16.90）pg/mL，（34.00±4.36）pg/mL，（403.30±7.22）pg/mL，P＜0.05］。接下来，用IL-8受体阻滞剂0.2 nmol/mL reparixin阻断CXCR1/CXCR2进一步探究TAMs对HCC侵袭作用的影响，结果发现Hep3B细胞和HepG2细胞侵袭数目与不加阻滞剂的Hep3B+TAMs组和HepG2+TAMs组相比分别下降了63.2%和59.20%（图2B，2F）。

接下来，进一步研究TAMs对Hep3B和HepG2细胞EMT的影响。在mRNA和蛋白水平，Hep3B+TAMs组和HepG2+TAMs组N-cadherin和β-catenin的表达均高于其余各组，而E-cadherin的表达均低于其余各组。Hep3B细胞，在mRNA水平各组间Snail和Slug的表达并无差异，而在蛋白水平Hep3B+TAMs组Snail和Slug的表达高于其余各组（图2C～D）。然而HepG2+TAMs组转录因子Snail和Slug的表达在mRNA和蛋白水平均高于其余各组（图2G～H），这说明与TAMs共孵可促进Hep3B和HepG2细胞EMT发生。上述研究结果表明IL-8活化的TAMs可以通过加强HCC细胞EMT过程，进而促进其侵袭转移的发生。

图1 IL-8对THP-1细胞的趋化和活化作用的影响

图2 TAMs对HCC EMT及侵袭转移的影响

2.3 HCC中TAMs浸润和临床病理指标的相关性

在HCC中CD68表达有较明显的异质性，不同组织切片其阳性细胞数目明显不同。在100例HCC的标本中，CD68阳性的TAMs高浸润（TAMshigh）的标本占52%（52/100），CD68阳性的TAMs低浸润（TAMslow）的标本占 48%（48/100）（图 3A）。其中，TAMshigh的CD68阳性的细胞均数为（61.92±14.78）个，TAMslow的均数为（29.65±5.48）个（P＜0.05，图3A）。接下来对TAMshigh和TAMslow两组的临床病理参数进行了比较，发现TAMs浸润和HCC患者年龄、性别、HBV感染、吸烟、肿瘤大小等临床病理指标无相关性，但是和患者是否饮酒及门静脉癌栓浸润相关。同时观察到TAMs浸润与包膜完整性具有相关性，统计分析呈边缘显著性（P=0.06，表1）。

2.4 HCC中TAMs浸润和IL-8表达的相关性

TAMshigh标本中IL-8的PR均值为43.65±25.36，而TAMslow标本为30.73±29.06，IL-8表达明显增加（P＜0.05，图3A）。TAMshigh标本IL-8染色强度高于TAMslow标本。Spearman秩相关分析显示TAMs浸润和IL-8表达呈明显的正相关（r=0.22，P＜0.05，图3B），表明IL-8可促使HCC组织中TAMs在局部聚集。

2.5 HCC中TAMs浸润与EMT的相关性

TAMshigh标本中N-cadherin和β-catenin表达水平较TAMslow标本增加，而E-cadherin的表达下降。Spearman秩相关分析显示，TAMs浸润仅与N-cadherin表达水平呈正相关（r=0.20，P＜0.05，图3B），而与E-cadherin和β-catenin的表达无相关性（P＞0.05），提示在HCC组织中TAMs浸润可促进HCC EMT的发生。

表1 TAMs浸润与HCC患者临床病理指标的相关性

图3 TAMs浸润和IL-8的表达及EMT相关指标的相关性（IHC×200）

3 讨论

肿瘤细胞与微环境之间的相互作用和联系主要是通过一个复杂的免疫因子网络实现的，如细胞因子、趋化因子和生长因子。IL-8作为重要的白细胞趋化因子，在肿瘤的发生发展中起到重要作用。在前列腺癌［6］、黑素瘤［7］和卵巢癌［8］等肿瘤的研究中，已证实IL-8能诱导血管生成并促进肿瘤的进展。Fujita等［9］在头颈部鳞状细胞癌中发现IL-8可以促进CD163+的TAMs的生成，同时与患者的预后不良存在一定的相关性，但是在HCC中鲜有报道。TAMs起源于骨髓祖细胞，表现出一定的异质性，根据TAMs活化后功能的不同可以分为两类［10］：TAMs M1型和TAMs M2型，两者可相互转化并影响肿瘤的发展方向。肿瘤微环境中多数TAMs表型和功能倾向于M2型［11-13］。在本研究中，发现IL-8对单核细胞系THP-1细胞具有明显的趋化作用，与文献报道相一致。IL-8刺激THP-1细胞48、72 h后，CD68+细胞的比例和M2型TAMs表型标记物CD206+CD163+细胞的比例增加，但是48 h的作用无72 h显著，同时IL-10的分泌量增加，提示IL-8在表型和因子两个方面促进THP-1细胞的表型向M2型TAMs方向极化。

活化后的TAMs在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。有相关研究发现［14］，在胃癌中TAMs可以促进胃癌EMT的发生，进而促进侵袭转移。Fan等［15］研究发现小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞可以促进小鼠HCC细胞系Hepa1-6发生EMT。同时该研究还发现TAMs可以促进小鼠HCC的Hepa1-6在小鼠体内的生长，表现为肿瘤的重量增加，同时体积增大。Fu等［16］研究发现TAMs可以通过JAK2/STAT3/Snail通路导致IL-8的分泌，促进HCC EMT的发生，进而促进侵袭转移。Deng等［17］研究发现TAMs可以促进HCC的侵袭转移，同时索拉菲尼可以抑制TAMs促进HCC侵袭转移的作用。在本研究中，IL-8活化后的TAMs与HCC细胞共孵育，发现TAMs在mRNA和蛋白水平均可促进HCC EMT的发生，提示IL-8活化的TAMs M2型通过促进HCC细胞EMT而提高HCC侵袭转移潜能，这一研究结果与文献报道相一致。同时，阻断IL-8受体后HCC侵袭作用并未完全消除，提示TAMs一方面可以通过分泌IL-8促进HCC侵袭转移，同时其还可以通过非IL-8介导的途径促进HCC侵袭转移。Wang等［18］研究发现在肺癌中TAMs可以促进IL-10的分泌，进而抑制肿瘤免疫，进一步促进侵袭转移。本研究中同样发现活化后TAMs中IL-10的分泌量明显增加，提示外源性IL-8诱导TAMs M2型可通过诱导局部免疫耐受而促进HCC侵袭转移。有研究表明［19］，在胃癌中TAMs可以通过促进MMP9和MMP2的表达，进而促进胃癌侵袭转移。

活化后的TAMs在肿瘤转移中发挥重要的作用。Yang等［20］研究发现在乳腺癌组织中TAMs的浸润较正常组织中明显增加，同时其5年生存率明显下降，淋巴结转移明显增加，这一研究结果表明TAMs可以促进乳腺癌转移，同时可以导致患者预后不良。相关研究表明，CD206+的TAMs M2型可以导致HCC患者的生存期缩短，是一种重要的预后影响因子［21］，但具体机制不清。本研究中，TAMs浸润和HCC患者门静脉癌栓浸润、肝包膜完整性具有明显的相关性，提示TAMs可以促进HCC的转移。

综上所述，IL-8将单核细胞趋化到肿瘤微环境后并将其进一步活化为TAMs，活化后的TAMs具有促肿瘤侵袭转移的作用。鉴于TAMs浸润与HCC侵袭转移相关，抑制IL-8释放或TAMs募集，可能为HCC靶向治疗提供新的方向。

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