miRNA在膀胱癌的凋亡通路机制及标志物研究进展

骆 阳，傅晓仪，孟民杰 (广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州510006)

0 引言

膀胱癌为全球高发的恶性肿瘤之一［1］。根据美国“膀胱癌——癌症统计资料”于2018年的统计数据,膀胱癌将成为第六大常见肿瘤。约95%的膀胱癌为移行细胞癌,其余约5%以鳞状细胞癌为主。

微小RNA(micro RNA,miRNA)是一种小的非编码RNA分子(包含约22个核苷酸),主要存在于植物、动物和一些病毒中,在RNA沉默和基因表达转录后调控起作用［2］。miRNA主要是通过与信使RNA(mRNA)碱基互补配对从而发挥分子生物学功能。miR分子可以通过以下三方面发挥作用：①miR链分裂成两段从而降解靶基因mRNA,miRNA与靶基因互补结合；②miR与靶基因不完全互补结合,在不影响mRNA稳定性的同时影响其翻译,mRNA通过核糖体转化成蛋白质的效率降低；③miR与靶基因作用,使 mRNA 通过缩短 poly［A］尾而失稳［3－4］。

许多的miRNA与癌症相关［5］。miRNA参与细胞的增殖、凋亡等过程,在多种肿瘤细胞中表达异常。细胞凋亡的启动受到激活机制的严格调控,一旦凋亡发生,必然导致细胞死亡［6］。所以,肿瘤研究多以细胞凋亡作为切入点进行深入研究。两种细胞凋亡激活机制是内源性途径(又称线粒体途径)和外源性途径。内源性途径主要分为依赖Caspase通路和非依赖Caspase通路。细胞色素C从线粒体中释放出来,它与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和ATP结合,然后与pro-caspase-9结合,形成一种称为凋亡体的蛋白复合物。凋亡小体将前caspase切割成caspase-9的活性形式,进而激活效应物 caspase-3［7］。 Bcl-2家族包括促凋亡蛋白如Bax、Bak和抗凋亡蛋白如Bcl-2、Mcl-1,在线粒体途径中发挥重要作用。非依赖Caspase通路是通过线粒体释放AIF(Apoptosis induce factor,凋亡诱导因子)而发生凋亡反应,但在细胞水平上难以检测［8］。外源性途径的凋亡机制主要是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)诱导的模型和Fas-FasL介导的模型,两者均涉及到与外部信号耦合的TNF受体家族的信号分子［9］。TNF-R1和Fas激活后,在 Bcl-2家族的促凋亡(Bax、Bid、Bak或Bad)和抗凋亡(Bcl-xL和Bcl-2)成员之间建立了平衡。这种平衡是在线粒体外膜中形成的凋亡前同聚二聚体的比例。凋亡前同型异构体需要使线粒体膜具有渗透性,以释放caspase激活剂。活性效应物caspase水解降解宿主细胞内的蛋白质以执行细胞死亡程序。细胞凋亡的大致过程可分为：接受凋亡信号、凋亡调控分子间的相互作用、蛋白水解酶的活化、进入连续反应过程。

1 miRNA在膀胱癌凋亡通路机制的研究进展

mTOR通路是调节细胞周期的重要细胞内信号通路。PI3K激活磷酸化并激活AKT,使其在质膜中定位［10］。 AKT具有激活 CREB、抑制 p27、在细胞质中定位 FoxO、激活 mTOR等下游效应,影响 p70和4EBP1 的转录［11－12］。 该通路被 PTEN、GSK3β、HB9等多种因子拮抗［11,13－14］。 在许多癌症中,该通路过度活跃,因此也成为研究热点之一(表1)。

1.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路 PI3K/AKT/

表1

本凋亡通路的miRNA研究主要集中于PI3K/AKT/mTOR的上游,即 PI3K、AKT、PTEN这 3个位点。由于凋亡通路之间是相互交通的,下游分子可能会涉及到多条分子信号通路。下游分子的主要研究集中于p53、p21和p27。p53是研究最多且较为明确的抑癌基因,并且与细胞周期相关。p21和p27也是周期相关的分子,AKT能靶向调控p27的表达。肿瘤细胞的细胞凋亡情况可用于疾病进展的动态监测。细胞周期与药物半衰期相关,肿瘤用药时间和间隔的确定可根据肿瘤细胞的周期情况进行调整。

1.2 MAPK/ERK信号通路 又称Ras-Raf-MEKERK通路,它将细胞表面受体的信号传递给细胞核内的DNA。这一途径包括许多蛋白质,包括MAPK(丝裂原激活蛋白酶,起初称为ERK,细胞外信号调节激酶),此通路成分是在癌细胞中发现的,也成为癌症治疗的研究靶向之一(表2)［38］。

此信号通路把细胞膜表面受体信号传递到细胞核中,研究主要集中在上游分子MAPK和ERK中。

1.3 JAK-STAT细胞通路 JAK-STAT信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。该通路将细胞外的化学信号传递到细胞核,通过转录过程激活基因。与其它信号通路相比,这条信号通路的传递过程相对简单,它主要由三个成分组成,即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子 STAT(表 3)［43］。

表2

表3

JAK-STAT细胞通路研究相对较多,因为此通路相对其他通路比较简单,只有JAK、STAT和酪氨酸相关受体3部分组成。JAK研究较多的是JAK1,STAT中研究较多的是STAT3。

1.4 Bcl-2家族 以其在线粒体中调节细胞凋亡最为著名。Bcl-2家族蛋白由促进或抑制细胞凋亡的成员组成,通过调控线粒体外模渗透(MOMP)来控制细胞凋亡,是细胞凋亡内通路的关键步骤(表4)［48］。

表4

Bcl-2家族中研究最多的是Bax和Bcl-2,miRNA对于肿瘤凋亡也主要集中研究此两分子。其中,Bax为促凋亡分子,同为促凋亡的家族分子有Bak、Bad和Bid等。Bcl-2为抗凋亡分子,同为抗凋亡分子的还有Bcl-xL。研究中多采用Bax/Bcl-2比值来表示凋亡的情况的进展,比值升高趋于凋亡,比值降低趋于抗凋亡。细胞凋亡是一个动态平衡的过程,通过Bax/Bcl-2的比值来确定肿瘤细胞的凋亡情况,可用于疾病进程和用药过程的动态监测。

2 miRNA在膀胱癌肿瘤标志物的研究进展

2.1 癌基因作用的miRNA 具有癌基因作用的miRNA在肿瘤发生的时候出现或者表达上调。其在肿瘤中表达,参与编码肿瘤形成的蛋白质,与肿瘤的生成和发展密切相关(表5)。

具有癌基因相关的miRNA大多的作用靶点位于凋亡相关通路。癌基因的作用主要通过调控凋亡信号通路上的分子来实现,参与癌基因的转录激活,与癌症的发生、发展、转化有着密切的关系。作为具有癌基因作用的miRNA,可作为肿瘤的诊断指标。通过动态检测癌基因作用的miRNA,可为用药检测以及疾病预后提供依据从而做出相关判断。

2.2 抑癌基因作用的miRNA 具有抑癌作用的miRNA能够保护细胞不受肿瘤侵袭,抑制肿瘤表达,参与编码抑制肿瘤形成的蛋白质。当其活性减少或消失时,细胞可能发展成为肿瘤(表6)。

表5

表6

具有抑癌基因的miRNA主要通过靶向调控凋亡相关通路分子和周期相关分子进行作用,在维持染色体稳定性、促进细胞分化与衰老以及调控细胞增生等过程起重要作用。具有抑癌基因的miRNA可在正常组织中存在并表达,在恶性病变组织中突变或者失活,可作为肿瘤诊断的标志物,也可作为肿瘤靶向治疗手段之一。

3 结论与展望

膀胱癌目前主要是以手术切除膀胱肿瘤、化疗、放疗等作为治疗手段,并且以影像学检查作随访［73］。无论是手术还是其他治疗方式,都有较大的副作用和一定的复发率。有创的治疗方法难以获得多数人的接受。无创的靶向治疗需求日益增长。

miRNA在肿瘤中参与分子信号转导,同时也可作为肿瘤标志物。随着对miRNA的深入机理研究,miRNA芯片技术也成为生物信息学的前瞻性课题和新思路。miRNA高通量检测技术一旦普及使用,将大大缩短检测时间,并且能够对miRNA和疾病的关系进行研究。miRNA作为癌症治疗的工具或者靶点都是相当有前景的［74］。靶向治疗被认为是癌症的最佳治疗方式,它能准确识别患者疾病本身及治疗过程中的进行性风险。在一些研究中发现特异性的miRNA作为肿瘤拮抗剂发挥作用,并直接靶向信号通路转录因子促进癌细胞凋亡。miRNA无论作为诊断标志物或治疗靶点,都与目前提倡的“精准治疗”不谋而合。miRNA可利用其表达水平来预测预后,也可作为治疗期间动态监测的靶标。

虽然miRNA能作为疾病标志物为临床提供诊治的依据,但现阶段临床诊疗指南中涉及miRNA作为诊断指标的仍然不多。目前膀胱癌的诊断依然以膀胱镜检查及脱落细胞学为金标准。许多疾病的发生出现了核酸层面的改变,但未达到细胞形态学改变,以至于疾病得到诊断的时候已经发展到比较后期阶段。miRNA的种类繁多,如何选择高效的生物标志物提高诊疗效率也是一个挑战。随着检测技术的发展和分子标志物的深入研究,miRNA有望成为肿瘤早期诊断的新标准。

miRNA在肿瘤中参与多种信号分子的靶向调控,有望作为日后肿瘤靶向治疗的手段之一。但目前miRNA仍处于基础研究阶段,对于将来用于临床治疗还有相当长的一段距离。miRNA对于肿瘤靶向治疗的技术开发也是目前的一大难题。随着分子生物学和基因治疗技术的发展,miRNA治疗癌症在将来是有可能实现的。