煤炭腐植酸对能源草柳枝稷耐盐性的促进作用

常 青 ，武文丽，黄高鉴，张训忠，杨治平

（1.山西大学生物工程学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西 太原 030031；3.美国弗吉尼亚理工大学土壤环境科学学院，美国 弗吉尼亚 24061）

盐渍土简称盐碱土，在我国盐渍土面积大约有66.1万hm2，山西有1.7万hm2[1]。盐碱地改良治理和开发利用在我国的农业发展历史上一直是一个比较严峻的问题，盐渍土对大多数作物会产生不同程度的危害，影响作物正常生长发育，降低作物产量，从而阻碍了农业的发展[2-5]。柳枝稷是低地型的多年生草本植物，原产于美国，它的土壤适应性很强，即使在非常贫瘠、洪涝、干旱和盐碱的环境下依然可以生长[6-7]。

植物抗氧化代谢与耐盐有一定关联，抗氧化酶可以消除自由基[8]。不同抗氧化酶的功能各有不同，在不同植物中起作用的抗氧化酶也不同。有研究表明，生长调节物质可以提高作物的耐盐性[9]。腐植酸是一种复杂的含有羧基、酚羟基等活性官能团的混合物，广泛存在于土壤有机质、泥炭、褐煤、风化煤及湖泊和海洋沉积物中，是由有机生物死亡后经生物降解所产生[10]。腐植酸在农业方面上的应用，国内外均已进行了大量的研究，并确认了腐植酸可促进植物新陈代谢，提高多种酶活性、叶绿素含量及植物抗逆能力[11-12]。

探讨耐盐植物选育研究的进展，对于进一步推动耐盐植物选育研究，加快盐碱地植被恢复具有重要意义。目前腐植酸对柳枝稷耐盐性的相关报道很少，是一个很新颖的研究方向。关于腐植酸对叶片的各项生理指标、抗氧化代谢及耐盐能力的影响机理还不清楚，本试验通过研究不同浓度的腐植酸处理对柳枝稷生长的影响，确定煤炭腐植酸对能源草柳枝稷耐盐性的促进作用，并选出适宜柳枝稷生长的腐植酸浓度。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

供试柳枝稷品种为阿拉莫（Alamo），于2017年3月在大同毛皂实验基地采种。

腐植酸为用KOH提取风化煤得到的产物，纯度在40%～50%，由山西省农业科学院环境与资源研究所提取。

1.2 试验设计

2017年4月，挑选大小一致、饱满的柳枝稷种子，用过2 mm筛的沙土在人工气候箱中育苗，昼夜温度设为28℃/20℃，光照时间为14 h/10 h，光强为400 lx。待长至2片叶时，移植到花盆中，放置到人工气候箱中培养至4片叶后，40 d后开始进行腐植酸处理。

试验随机区组排列，每处理重复5次。盐胁迫处理（先喷施腐植酸，再灌施NaCl溶液，且灌施NaCl溶液时成梯度进行，3 d后达到250 mmol/L）（表1）7 d后，取样备测。

表1 不同处理的盐浓度和腐植酸浓度

1.3 测定方法

1.3.1 叶片相对含水量 取第2片完全展开叶约50 mg，用剪刀剪成5 mm的片段，记录鲜质量（FW）后，立即放入2 mL的离心管中并加入1 mL的蒸馏水（保证所有叶片都浸入水中）。放入4℃冰箱12 h后，放入平板上用纸巾擦干，记录含水量（TW）；之后放入75℃的烘箱中，烘干24 h，记录干质量（DW）。叶片相对含水量（RWC）计算公式如下。

1.3.2 电解质外渗 取第2片完全展开叶约50 mg，用剪刀剪成5 mm的片段，记录质量后，放入50 mL的带盖离心管中（耐高温），并加入20 mL的蒸馏水，盖好盖子放置摇床震荡24 h，测定EC1；去掉盖子，用锡箔纸包紧放入120℃的高温灭菌锅中30 min，测定EC2。叶片电导率（EC）计算公式如下。

1.3.3 光合作用参数 使用LI-6400XT光合仪测量光合速率、气孔导度、蒸腾速率，记录并整理数据。

1.3.4 叶绿素 使用叶绿素仪，每组处理的每片叶子测量3个位置，并记录整理，得出结果。

1.3.5 叶片抗氧化物活性

1.3.5.1 超氧化物歧化酶（SOD） 取新鲜样品并立即用液氮冷冻，冷冻样品储存于-80℃。用研钵（含液氮）研磨样品并在2 mL微量离心管中称100 mg样品，加入1.8 mL提取溶液（0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 值为 7.0；0.2 mmol/L EDTA，1%（w/v）PVP）充分混合，并且将混合物在冰浴中停留约30 min。以12 000 r/min 4℃离心20 min。收集上清液（0.8 mL）并转移到新的微量离心管中，用于酶活性分析。

准备具有均匀颜色和质地或比色杯的干净的试管，并将以下试剂转移到管中：50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 值 7.8，0.9 mL），10 μL的 10 mmol/L EDTA，30 μL的 SOD（超氧化物歧化酶），100 μL的0.13mol/L甲硫氨酸，10 μL的6.3mmol/LNBT，10 μL的130 μmol/L核黄素。用石蜡膜密封后充分混匀。将试管放入玻璃支架中，在25℃下打开环形荧光灯（辐照度为60 μmol/（m2·s））开始反应，关闭灯10 min后停止反应。开始时保持器中的试管放置在旋转器上，使得每个样品在反应期间接收相同量的光。反应后，用分光光度计测量560 nm处的吸光度，记录并整理数据。

1.3.5.2 抗坏血酸过氧化物酶（APX） 准备清洁的试管，颜色均匀，质地好，试管中加入：50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 值为 7.0，0.87mL），10 μL的 50mmol/L抗坏血酸，10 μL 的 10 mmol/L EDTA，100 μL 抗坏血酸过氧化物酶提取物。采用石蜡膜密封比色杯，并充分混匀。加入10 μL10 mmol/LH2O2开始反应，并立即测量290 nm处的吸光度，1 min后测量第2次。

1.3.5.3 过氧化氢酶（CAT） 准备具有均匀颜色和质地的干净试管，将以下试剂转移到管中：50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 值为 7.0，0.96 mL），10 μL 的1.5 mol/L H2O2。加入30 μL酶提取物，立即测量240 nm处的吸光度，反应1 min后测量第2次。反应开始后使用缓冲液作为空白。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS软件进行单因素方差分析，采用Duncan新复极差法比较不同数据组间的差异，显著性水平设定为α＝0.05；使用Excel柱状图分析变化。

2 结果与分析

2.1 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷的叶片相对含水量变化

由图1可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的相对含水量出现一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片相对含水量不存在显著性差异；7 d后，不同处理的叶片相对含水量发生一定程度的变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）与对照组的叶片含水量存在显著性差异，且较对照组明显下降了20%～30%；处理1与处理2、处理3和处理4存在显著性差异；处理2、处理3、处理4之间不存在显著性差异，处理2、处理3与处理4叶片相对含水量比处理1的叶片相对含水量下降少。

不同浓度的腐植酸处理下，对柳枝稷耐盐性的影响程度不同。一定浓度的腐植酸可以相对降低叶片水分的散失。本试验结果表明，施用0.2%和0.4%浓度的腐植酸可以减少叶片水分的散失，从外观看可以维持盐胁迫下柳枝稷的正常生长。

2.2 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的电解质外渗变化

从图2可以看出，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐胁迫处理的天数增加，柳枝稷的叶片电解质外渗的变化较大。第1次取样5组处理的叶片电解质外渗不存在显著性差异；7 d后，不同处理的叶片电解质外渗发生变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）较对照组显著增加，增加了40%～50%；处理1较处理2、处理3和处理4增加的最大，处理2、处理3和处理4之间不存在显著性差异，但处理3叶片的电解质外渗上升的最少，上升了40%。

不同浓度的腐植酸处理下，对柳枝稷耐盐性的影响程度不同。一定浓度的腐植酸可以降低叶片电解质外渗的增加。本试验结果表明，施用0.2%的腐植酸可以减少盐分的积累，减少对植株的危害。

2.3 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的光合速率变化

由图3可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的光合速率出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片光合速率不存在显著性差异；第7天不同处理的叶片光合速率发生变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、处理 3（250mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）较对照组均显著减少。处理1与对照组、处理2、处理3和处理4间存在显著性差异，受盐胁迫影响最大，叶片光合速率降低最多。处理3的叶片光合速率为处理1、处理2和处理4中下降最少的，与处理2和处理4的叶片光合速率间不存在显著性差异。

2.4 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的气孔导度变化

由图4可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的气孔导度出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片气孔导度不存在显著性差异；盐处理7 d后，不同处理的叶片气孔导度发生变化。对照组的叶片气孔导度变化与其他4组存在显著性差异；处理2（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）与处理 1（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）叶片气孔导度变化不存在显著性差异，但与处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的叶片气孔导度变化存在显著性差异，显著下降80%左右；处理3与处理4叶片的气孔导度变化不存在显著性差异。

施用0.2%，0.4%的腐植酸可以一定程度的减少叶片气孔导度的下降，使柳枝稷的气孔开张程度维持相对正常状态。气孔导度过低，使得气孔关闭，严重影响细胞的正常运转。

2.5 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的蒸腾速率变化

由图5可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的蒸腾速率出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片蒸腾速率不存在显著性差异；但盐处理7 d后，不同处理的叶片的蒸腾速率发生变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）较对照组显著下降，处理3、处理4的叶片蒸腾速率变化不存在显著性差异，处理1下降程度最大。

不同浓度腐植酸处理对柳枝稷耐盐性的影响程度不同。一定浓度的腐植酸可以增加净光合速率、调节气孔导度及蒸腾速率。本试验结果表明，施用0.2%的腐植酸可以显著增加柳枝稷叶片的净光合速率、调节气孔导度、降低蒸腾速率、防止生理干旱。蒸腾速率的下降可以在一定程度上降低叶片水分散失，但下降过多可能会对细胞造成一定程度的伤害，严重时可导致植株死亡。

2.6 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的叶绿素含量变化

由图6可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的叶绿素含量出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片叶绿素含量不存在显著性差异；但盐处理7 d后，不同处理的叶片叶绿素含量发生变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）较对照组显著减少；处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）与对照组间不存在显著性差异。盐处理后，4组叶绿素含量都降低了，处理3（除对照组外）较其他3组下降的程度最少。

2.7 对叶片的抗氧化酶活性影响

2.7.1 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的超氧化物歧化酶活性变化 由图7可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的超氧化物歧化酶活性出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片超氧化物歧化酶活性不存在显著性差异；7 d后，不同处理的叶片超氧化物歧化酶活性发生变化。处理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）与对照组间不存在显著性差异；处理3（250mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）和处理4（250mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的叶片超氧化物歧化酶活性存在显著性差异，2组处理较对照组都显著增加，且处理3增加的幅度最大。

2.7.2 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性变化 由图8可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片抗坏血酸过氧化物酶活性不存在显著性差异；但盐处理7 d后，不同处理的叶片抗坏血酸过氧化物酶活性发生变化。处理1（250 mmol/LNaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）较对照组不存在显著性差异；处理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的叶片抗坏血酸过氧化物酶活性不存在显著性差异，2组处理较对照组都显著增加；处理3和处理4增加的幅度最大。

2.7.3 施用不同浓度腐植酸处理盐胁迫下柳枝稷叶片的过氧化氢酶活性变化 由图9可知，在煤炭腐植酸的处理下，随着盐处理天数的增加，柳枝稷叶片的过氧化氢酶活性出现了一定程度的变化。第1次取样5组处理的叶片过氧化氢酶活性不存在显著性差异；但盐处理7 d后，不同处理的叶片过氧化氢酶活性发生变化。处理1（250 mmol/LNaCl；0%腐植酸）、处理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）与对照组不存在显著性差异；处理3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和处理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的叶片过氧化氢酶活性存在显著性差异；处理3的叶片过氧化氢酶活性最高。

3 结论与讨论

3.1 结论

施用腐植酸对盐胁迫下的柳枝稷有一定的促进作用，可以适当提高柳枝稷叶片的相对含水量、叶绿素含量、光合速率、气孔导度、叶片蒸腾速率以及抗氧化酶含量，适当降低电解质外渗。本试验得出适宜腐植酸浓度可适当增强柳枝稷的耐盐性，其中，施用0.2%的腐植酸在本试验中的作用最大，综合效果最好。

3.2 讨论

本研究表明，一定浓度的盐胁迫会伤害柳枝稷。试验第7天，盐胁迫对柳枝稷伤害明显，叶片出现萎蔫发黄现象。造成的原因应该是基质保水性太强，浇水量大造成柳枝稷根系呼吸困难，生长受抑制。这与前人[13-14]的研究结果有所不同。以后研究柳枝稷耐盐机理时，应适当减少盐浓度梯度。

本试验结果表明，腐植酸可以适当提高盐胁迫下柳枝稷叶片的叶绿素和光合速率。前人研究表明，光合速率对柳枝稷耐盐性而言，是一个非常重要的指标[15]。处理 3（250 mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）经过7 d的盐处理后光合速率较其他组盐处理的光合速率最高，说明腐植酸可增加它的光合速率从而增强柳枝稷叶片的耐盐性。蒸腾作用降低可以使细胞减少水分的散失，维持细胞正常的生理活动。蒸腾作用有2种方式，一种是根压，它是在植物小的时候所才用的主要吸水方式，因为没有叶片。当植物长出叶片是就采用蒸腾拉力来吸收水分。蒸腾作用所产生的蒸腾拉力为植物输送水分以及矿物质，也为植物进行光合作用提供营养源[16]。施加腐植酸后，光合速率和蒸腾速率二者促进柳枝稷的正常生长，减小盐胁迫的危害，从而提高了植株的耐盐性。

植物对耐盐性存在一种防卫机制。3种酶的抗氧化原理表明，它们无害，具有一定的促进作用[17]。SOD，APX，CAT的活性高可以提高柳枝稷叶片的长势，消除自由基，从而增强它的耐盐性[18]。但是三者之间的功能有些不同，消除的自由基的种类也不相同，主要取决于当时细胞内的情况。虽然有些酶活性比较低，但不能排除其作用大的可能，若要准确确定某种酶的作用机制需要测量中排除其他酶。

渗透调节也可以一定程度的影响耐盐性[19]。盐胁迫能一定程度使得细胞吸水受抑制。前人研究证明，脯氨酸的积累可以减少细胞吸水的限制[19-20]。但是怎样的调节还不清楚，可能是一种信号分子诱导合成，可以测定叶片脯氨酸的含量，探究脯氨酸的调节机制。

本试验只是初步研究腐植酸对柳枝稷的耐盐性的影响，其中每个指标研究的次数过少，所以，只能预测整体趋势。下一步应需要完善方案，进行深入的研究。

［1］何文义，于涛，蔡玉梅.盐碱地的治理与利用[J].辽宁工程技术大学学报（自然科学版），2010，29（3）：158-160.

［2］陈壬生，胡镇修，张木祥，等.不同类型盐碱土对红麻生长的影响[J].中国麻作，1995，17（2）：4-7.

［3］唐于银，乔海龙.我国盐渍土资源及其综合利用研究进展[J].安徽农学通报，2008，14（8）：19-20.

［4］周和平，张立新，禹锋，等.我国盐碱地改良技术综述及展望[J].现代农业科技，2007（11）：159-161.

［5］高亮，丁春明，王炳华.生物有机肥在盐碱地上的应用效果及其对玉米的影响[J].山西农业科学，2011，39（1）：47-50.

［6］章春彪，陆国权.柳枝稷研究进展[J].现代农业科技，2013（11）：175-180.

［7］马永清，郝智强，熊韶峻，等.我国柳枝稷规模化种植现状与前景[J].中国农业大学学报，2012，17（6）：133-137.

［8］马博英.多年生黑麦草的逆境生理研究进展 [J].生物学杂志，2010，17（2）：335-337.

［9］吴雪霞，陈建林，查丁石.外源一氧化氮对NaCl胁迫下番茄幼苗活性氧代谢的影响 [J].植物营养与肥料学报，2009，15（2）：422-428.

［10］陈玉玲.腐植酸对植物生理活动的影响 [J].植物学通报，2000，17（1）：11-16.

［11］张辉，姜文勇，刘波.不同来源腐植酸促进植物生长活性及作用机理研究[J].腐植酸，2000（2）：16-18.

［12］李卓杰，刘晾，周世宁.腐植酸对植物生长的影响[J].腐植酸，1991（1）：38-48.

［13］范希峰，侯新村，朱毅，等.盐胁迫对柳枝稷苗期生长和生理特性的影响[J].应用生态学报，2012，23（6）：1476-1480.

［14］于晓丹，杜菲，张蕴薇.盐胁迫对柳枝稷种子萌发和幼苗生长的影响[J].草地学报，2010，18（6）：811-822.

［15］严萍.含腐殖酸调理剂对小麦、水稻幼苗生长和产量的影响[D].扬州：扬州大学，2016.

［16］张中典.温室环境因子对黄瓜水分传输及蒸腾作用影响研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2016.

［17］梁潘霞，廖青，邢颖，等.干旱胁迫下Si对甘蔗叶片相对水含量和抗氧化物酶活性的影响[J].南方农业学报，2014，45（12）：2188-2192.

［18］王自霞.玉米种子人工老化及其修复的研究[D].太原：山西大学，2008.

［19］张素娜.生物材料中脯氨酸的作用及其反应动力学的研究[D].保定：河北大学，2007.

［20］陈英华，严重玲，李裕红，等.盐胁迫下红海榄脯氨酸与活性氧代谢特征研究[D].厦门：厦门大学，2014.