结核性脑膜炎实验室诊断方法及其改进策略

王义义 综述 张 伟 审校

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis ,TBM)属于神经系统结核病，是非常严重的肺外结核病。TBM病变累及软脑膜、蛛网膜、脑实质、脑血管，是结核病死亡的主要原因之一，有很高的病死率和致残率[1]。 TBM预后与诊断早晚以及治疗是否及时有密切关系。由于TBM早期临床表现特异性差，常被误诊为隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎等疾病而延误治疗，因此临床诊断困难，病死率和致残率高。根据文献[2,3]报道TBM病死率为10%～36.5%。及时诊断，早期治疗是改善TBM预后，减少TBM死亡和致残的重要策略之一，尽早明确诊断是治疗成功的关键所在。根据2011年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的数据，仍有一大部分TBM的患者没有得到及时的诊断和治疗，因而致残甚至死亡[4]。TBM的误诊率达到31.6%，早期1周内诊断率仅为10%[1-4]。近年，TBM的实验室诊断方法取得很多进展，临床医生需要了解实验室检测方法，提高诊断水平。笔者旨在对目前TBM实验室诊断方法及改进策略进展进行综述。

1 病原学检查

1.1 抗酸染色 抗酸染色，也叫齐-尼染色法，由两名德国医师首先描述，已经使用一个多世纪。在结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)鉴定中的作用举足轻重，但是抗酸染色阳性率低，阳性发现要求的最低菌量为102个/ml，而可靠的阳性发现需要的菌量为104个/ml。TBM是少菌型结核病，脑脊液中的菌量只有100～102个/ml[5]。因此，抗酸染色在TBM诊断中阳性率低，文献[6]报道只有10%～20%。改进策略主要包括增大脑脊液量，延长镜检时间和使用荧光显微镜镜检。有研究报道，增加脑脊液的检测量(>6 ml)，延长检测时间可以提高阳性率到58%[6]。另有研究报道，荧光显微镜镜检能提高痰液抗酸染色的阳性率，提高10%的敏感度[7]。但是，对于肺外标本，目前还没有足够的证据证实荧光检测的诊断价值。

1.2 结核分枝杆菌培养 TBM患者脑脊液中的Mtb培养敏感度很低，培养时间长。据国外文献[6, 8]报道，敏感度为36%～81.8%。传统的固态培养液需要8周培养确定阴性结果。在以肉汤为基础的培养液中Mtb倍增时间明显减少(13 dvs26 d)[9]，但是仍需要6周才可确定阴性结果。因此Mtb的培养鉴定只能作为TBM的纳入检验，而不能作为排除检验。为了提高阳性率，有研究报道，延长培养时间至10周可以提高培养的阳性率[10]。为了缩短培养时间，一项来自瑞士的报道，研究了Mtb在双相培养液中培养结果阳性出现的时间，结果显示58.3%的培养阳性出现在14 d之内，37.5%出现在21 d之内，4.2%在28 d之内，因此建议Mtb快速培养的时间可以缩短至4周[11]。

1.3 药物敏感性镜下检测分析法 药物敏感性镜下检测分析法(microscopic observation drug susceptibility, MODS)在2000年由 Caviedes等[12]提出。将脑脊液置于含有特异的液体培养液的微孔板中培养，在倒置显微镜下观察，Mtb形成特征性的索样结构。据文献[13]报道，脑脊液Mtb培养检测时间中位数为6 d，敏感度为65%。MODS还可用于药敏检查，文献[14]报道，异烟肼药敏检测结果的符合率为95.7%，利福平为96.8%。2011年WHO推荐MODS 作为Mtb培养及耐药鉴定的方法之一。

2 分子生物学检查

TBM是一种少菌型的结核病，因此病原学检查的应用受到限制。分子生物学技术为Mtb的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便。主要包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。临床最常使用的是核酸扩增实验(nudeic acid amplification technology, NAATs)。自1990年开始NAATs用于脑脊液标本中Mtb核酸的检测[15]。NATTs可以检测到的最低菌量为10个/ml以下的临床标本[16]。

2.1 聚合酶链反应(PCR) 是使用最为普遍的分子生物学检查方法。可选择的方法包括实时荧光PCR、环介导等温扩增法(LAMP)、转录介导扩增法(TMA)[17]。对于PCR诊断TBM的敏感度和特异度没有权威的数据评价，文献报道差异悬殊。大多数实验室使用的商业化试剂盒在脑脊液Mtb的检测中敏感度低，据国外文献[18]报道为56%。因此PCR不能用于TBM的排除诊断，也不能取代传统的病原学检测。

2.2 Xpert MTB/RIF分析(Cepheid,Sunnyvale, CA) 可以在2 h内检测Mtb基因以及利福平耐药。检测过程全自动，只需两歩人工步骤，手动时间不超过5 min。所检测标本中最低只需4.5个基因组。2010年WHO推荐Xpert MTB/RIF分析应用于痰液Mtb的检测。在痰液检测中敏感度高于抗酸染色(98% vs 68%)。虽然WHO并未推荐其在脑脊液中的应用，但是研究者也在探索Xpert MTB/RIF检查在脑脊液中的应用，并取得了成果。据文献[19, 20]报道脑脊液中Xpert MTB/RIF的敏感度为27%～86%。但是由于样本量小，评估还需要扩大样本。Xpert MTB/RIF检测Mtb的同时可以用于利福平耐药检测，并被WHO推荐。但是Xpert MTB/RIF分析利福平耐药的特异性较低，WHO推荐需要用传统的药敏实验排除假阳性的结果[21]。

3 免疫学检查

3.1 细胞免疫检测技术 γ-干扰素释放实验(Interferon Gamma Release Assay, IGRAs)是在全血中检测机体对于Mtb抗原的免疫反应，包括测定全血中γ-干扰素的检测[QuantiFERON-TB©Gold In Tube (QFT-IT);Cellestis Limited Chadstone, Vic., 澳大利亚]以及周围血单个核细胞的γ-干扰素的检测(T-SPOT.TB; Oxford Immunotec, Abingdon, 英国)，是一种Mtb感染的细胞免疫检查。细胞免疫在Mtb感染中发挥主要的作用，当机体感染Mtb时，巨噬细胞通过toll-样受体(Toll- like receptor, TLR)识别Mtb，通过胞吞控制Mtb。同时巨噬细胞释放IL-12，诱导T细胞释放IFN-γ，IFN-γ再刺激巨噬细胞的胞吞以及对于Mtb的氧化性损伤[22]。IGRAs的敏感度高，因此得到广泛的关注。但是研究表明，IGRAs在诊断活动性结核病中比较结核菌素试验，并没有更高的敏感度[23]，不能鉴别结核病是活动性结核病还是潜伏性结核病。在TBM的诊断中，有研究者将其改进，直接检测脑脊液中IGRAs，用于诊断TBM[24]，检测脑脊液中IFN-γ的表达可用于TBM的诊断，并取得了令人鼓舞的诊断结果。虽然其敏感度在不同的研究中报道不同[25, 26]，并且该项检测需要脑脊液量大(6～10 ml)，但是其诊断价值非常值得进一步研究。

3.2 体液免疫检测 包括Mtb抗原检测和抗体检测。抗体检测方法主要用于检测结核患者血清中的特异性抗体。目前并没有取得实质性的进展，没有研究证据表明抗体检测有足够的灵敏度和特异度，并不能作为结核病纳入或排除的诊断依据。因此WHO不推荐将结核抗体检测作为诊断结核病依据[27]。2001年，有研究发现麻风病患者和Mtb致敏的患者体中的T细胞可以识别Mtb6 kD早期分泌蛋白 (ESAT-6)和thologue蛋白[28]。这项发现促进了将Mtb抗原作为结核病诊断标记物的研究，如将MPB-64抗原用于周围血和尿液标本的检测、ESAT-6抗原用于脑脊液标本检测、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)用于尿标本的检测[29，30]。这些研究都展现出一定的诊断价值，但是目前尚未广泛用于临床。

4 生物化学检查

脑脊液生物化学检查包括腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme , ACE)等。ADA是用于鉴别TBM与病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎常用的指标之一。ADA是一种核酸分解代谢关键酶，在T淋巴细胞中含量最高。ADA的水平与T细胞接受Mtb抗原刺激，产生反应相关。很多研究证实了ADA在TBM诊断中的价值，但是结论有矛盾之处, 且敏感度不高。在一项以病原学确诊的TBM患者的研究中，ADA的敏感度为29.9%[31]。脑脊液中临界值一般定于8 U/L。为了改进ADA在TBM诊断中的灵敏度和特异度，不同的研究探讨了ADA的临界值，改进了ADA的应用，研究的范围为5.0～15 U/L[32]。不同的临界值有不同的敏感度和特异度。一项研究提示ADA在1～4 U/L时，其敏感度>93%，特异度 <80%，可用于排除TBM诊断；ADA在4～8 U/L时，既不能确诊也不能排除TBM；ADA>8 U/L时, 其敏感度<59%，特异度 >96%，可用于确定TBM诊断。根据ROC曲线分析，ADA理想的临界值为5.3 U/L (敏感度和特异度均为84%)[33]。

总之，提高TBM的生存率改善预后的关键是快速诊断和启动抗结核治疗。在TBM的诊断方面已经取得很大的进展，由于TBM是少菌型结核病，脑脊液中菌量低，限制了一些诊断方法的使用。临床医师仍然要通过临床检查、脑脊液检查、影像学改变及评分系统综合判断。临床医师需要了解各项诊断方法的特征，从而综合判断TBM的诊断。