血红素氧合酶1与肾缺血再灌注损伤的研究进展

王 涛 综述 王群锁 审校

综述

血红素氧合酶1与肾缺血再灌注损伤的研究进展

王 涛 综述 王群锁 审校

血红素氧合酶；肾脏；缺血再灌注损伤

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种高致死率和致残率的常见疾病，临床缺乏有效的鉴别和干预手段。大部分的急性肾损伤病例并非是由原发性的肾脏疾病引起，而是由于脱水、手术或者败血症等全身性疾病导致肾脏灌注不足。如果肾脏灌注得不到及时恢复，肾脏就会发生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)，导致急性肾小管坏死和急性肾损伤。血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)最早于20世纪60年代末在肝脏微粒体中被分离出来，是血红素降解转化为胆绿素的限速酶。多项研究显示HO-1在肾缺血再灌注损伤中被大量诱导，是一种能减轻氧化应激反应的保护性应答，具有潜在的抗氧化、抗炎及抗凋亡活性。笔者将HO-1与肾脏缺血再灌注损伤的研究进展综述如下。

1 HO-1的生物学特征及功能

HO是微粒体的细胞保护酶，可被损伤和细胞应激等诱导应答。目前已知的血红素氧合酶有三种，HO-1、HO-2和HO-3，HO-1是最典型的诱导型酶。人类HO-1基因长度为13 kb，定位于染色体22q12，该基因编码一个288个氨基酸组成的单体，分子量为32 kDa。翻译后修饰能够影响HO-1的大小及功能[1]。HO-1可被多种细胞应激因子诱导表达，游离血红素诱导的氧化应激是HO-1诱导的重要病理学机制之一。另外，重金属、内毒素、紫外线照射、前列腺素类、过氧化氢、特定的生长因子、细胞因子和其他的刺激都能诱导肾脏内HO-1生成[2]。HO-1能够催化血红素生成胆绿素、Fe2+和CO，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下生成胆红素。Fe2+参与机体铁蛋白合成；含铁蛋白能够吸收铁离子，防止铁离子诱导的氧化应激；胆绿素和胆红素能够清除氧自由基，防止脂质过氧化；CO能够扩张血管并抑制炎性因子的表达[3]。

2 HO-1在肾脏中的表达与功能

健康肾脏中HO的活性主要为组成型HO-2的活性，HO-2广泛表达于入球小动脉、髓襻升支、末端卷曲及集合管中。HO-1仅在近端和远端小管、亨勒袢及髓质集合小管内有极微量的表达。HO的活性改变能够调控肾脏的血流动力学，在肾动脉内直接注射HO活性抑制药能够显著减少肾小球滤过率、肾血流及肾脏NO的产生，CO释放分子可以逆转上述影响。另外，肾血管中的CO能够减轻不同激动药对肾血管的收缩作用，当肾NO生成受到抑制时，作为代偿机制，肾脏CO的生成显著增加。因此可以说，健康肾脏的肾小球滤过率和肾血流至少部分受到HO的基础活性和CO的血管舒张作用的影响，后者更依赖于肾脏NO的生成。另外，HO活性能够促进亨勒袢内的钠和水的吸收[4]。

肾移植、肾脏疾病等损伤应激中HO-1在肾小管、肾小球、肾间质及肾单核巨噬细胞中大量表达，在AKI动物模型中，HO-1主要是在近端小管内皮细胞大量表达，糖尿病模型中HO-1在肾小球细胞内表达，而在急性肾移植排斥反应中HO-1在浸润巨噬细胞中表达。蛋白尿性肾病中HO-1表达上调更倾向于在肾小管而非肾小球细胞，可能与这些细胞对氧化应激的敏感性和反应性不同有关。蛋白尿状态下HO-1在肾小管内皮细胞被诱导表达，并不能简单地归于增加近端肾小管对白蛋白的运输，这种表达更多的反映了与肾小球疾病、炎性反应、氧化剂或其他泌尿系问题同步发生的肾小管内皮细胞的损伤[5]。

3 HO-1在急性肾缺血再灌注损伤中的保护作用

小鼠双侧肾动脉缺血30 min后再灌注能显著提高肾脏血红素含量并诱导HO-1表达[6]。单侧肾切除大鼠模型中血红素含量增加HO-1被诱导表达。大鼠经HO抑制药Snpp处理后，肾脏血红素水平增加，出现肾功能损伤及大范围的肾小管内皮细胞损伤[7]。在肾IRI导致的氧化应激能够上调NF-κB及MCP-1水平，这些信号分子能够募集单核细胞和巨噬细胞至缺血部位[8]。与野生小鼠相比，HO-1缺失小鼠双侧肾缺血10 min后，表现出更严重的肾功能损害，及更高水平的MCP-1和NF-κB[9]。在肾脏IRI过程中的小鼠静脉中含有过表达HO-1的骨髓衍生巨噬细胞聚集至损伤肾脏。Cheng等[10]最新的研究显示脂连素通过PPARγ通路及环加氧酶2上调HO-1表达保护IRI诱导的肾损伤。最近Hull等[11]发现HO-1缺失小鼠与野生小鼠相比，对双侧肾缺血10 min更为敏感，当这些小鼠双侧肾IRI达到25 min时，他们表现出更多数量的肾管型、持续性的近端小管刷状缘缺失、胶原沉积增加及纤维化。以上研究证实了HO-1在肾脏IRI中的重要保护作用。

4 HO-1在肾脏缺血再灌注损伤中的保护机制

肾脏IRI中HO-1的诱导所产生的肾脏保护机制复杂，HO-1的表达和激活不仅能够去除潜在的细胞刺激原，并且产生生物活性代谢产物。研究显示，IRI诱导的HO-1激活使得CO释放分子(CORM)数量增加，CORM作为体内CO的供体，持续释放CO，后者是HO-1诱导后肾脏保护作用的关键因素。

4.1 对肾血流和微循环的影响 抑制健康肾脏中HO-2和HO-1的活性能够导致髓质血流减少，证实了HO-1在生理状态下对髓质血流再灌注的影响。血红素预处理供体大鼠诱导HO-1表达，在随后的移植中显示肾脏功能更持久，肾内血管直径和毛细血管血流量均有增加，目前认为是CO通过它潜在的血管收缩和抑制血小板聚集功能所起到的改善循环的作用[12]。显微穿刺术的研究显示，SnMP诱导的HO-1表达抑制了肾小管球间反馈诱导的入球小动脉收缩。给予CORM或外源性的胆绿素也可以得到相同的效果，说明血红素代谢物介导了这个反应[13]。在大鼠移植过程中联合吸入CO及注射胆红素，能够共同提高移植体的存活率和肾小球滤过率及加快血流速度。

4.2 HO-1对细胞凋亡和存活的影响 HO-1对细胞有保护作用，同时HO-1能够减少细胞的凋亡和坏死。有研究显示CO在生理学浓度时是一种抗凋亡信号。体外研究显示HO-1能够诱导细胞周期蛋白激酶抑制药P21促进肾小管内皮细胞的存活[14]。

4.3 自噬反应 自噬是一种胞内降解系统，是细胞利用溶酶体酶，降解自身受损细胞器和异常蛋白等大分子物质，维持细胞内环境稳定的真核细胞特有的生命现象。失调的，延长的和不完全的自噬会导致有害的细胞内物质聚集，最终导致细胞死亡。自噬在急性肾损伤中是一种保护机制。HO-1的诱导能够促进自噬及细胞存活。最近的研究显示，在肾IRI的动物模型中自噬现象被诱导，自噬相关基因表达升高。氧化应激能够触发自噬，导致细胞生存或死亡，HO-1通过氧化应激应答来调节细胞自噬[15,16]。

4.4 免疫调节 由IRI损伤引起的炎性反应加剧了AKI的严重程度、恢复不全及提高了发展成为慢性肾疾病的概率。原发免疫细胞如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞等是对急性损伤最主要的应答者，HO-1在这些细胞中起到非常重要的免疫调节作用。在球HO-1敲除小鼠和HO-1缺失的人群中均表现出白细胞增多、红细胞吞噬作用、肝脾肿大及伴随炎细胞浸润的肾小管间质性损伤和纤维化。球HO-1缺失小鼠还表现出MCP-1水平增高[17]。巨噬细胞表达HO-1，具有抗炎倾向，分泌IL-10等抗炎因子并表达对AKI后组织恢复极为重要的修复基因。IL-10表达的有益作用依赖于HO-1的活性和表达。IRI之后，巨噬细胞聚集在HO-1缺失小鼠的损伤肾内，高表达致炎因子IL-6, 低表达抗炎因子IL-10。这些研究进一步说明了HO-1通过免疫调节对肾脏IRI的保护作用。HO-1还能够调节免疫细胞的迁移能力。HO-1缺失小鼠在AKI中能够增加巨噬细胞在损伤肾中的聚集，HO-1的缺失能够促进骨髓系细胞(巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞)从损伤肾流出到外周淋巴系统，推测是为了抗原呈递和加强免疫应答[18]。肾脏发生IRI之后骨髓细胞内HO-1表达的诱导能够激活减轻免疫应答的反应途径。抗原呈递细胞内HO-1的表达能够调节T细胞功能，促进AKI后肾脏恢复。另外，HO-1的反应产物也能调节免疫应答，CO也能抑制树突细胞的迁移，通过下调IL-2抑制T细胞增殖。这些研究提示了在肾脏IRI后HO-1的免疫调节作用[19]。

4.5 氧化应激 肾IRI的发病机制中，氧化应激反应能够导致细胞内血红蛋白失稳定、器官损伤及细胞死亡。多个肾脏IRI动物实验表明，氧化应激能够诱导HO-1，这种诱导能够起到肾脏保护功能。HO-1诱导对抗氧化应激造成损伤的保护性机制主要有两个方面：第一是HO-1的诱导能够催化血红素的降解。血红素是一种潜在的促氧化剂和毒性刺激，能够加强肾损伤动物模型中氧化应激的作用，血红素能够刺激肾小管内皮细胞过氧化氢的生成，而且通过氢和过氧化物脂质的相互作用形成血红素的促炎性反应形式加强氧化应激。第二是HO-1激活后能够产生抗氧化和抗凋亡的代谢产物。胆红素和胆绿素能够排除亚硝酸盐等自由基，抑制脂质过氧化从而减轻氧化应激，另外在胆绿素转化为胆红素时能够吸收过氧化氢减轻氧化应激，胆红素能够抑制NADPH氧化酶的活性，减少氧自由基的产生。另一个HO-1反应的产物是CO，一个强效的抗凋亡和抗炎分子。CO都能够削弱体内的氧化应激反应[20]。另外HO-1的诱导能够提高Ft的水平，后者也具有抗炎效果。

5 HO-1作为肾IRI治疗靶点的研究新进展

5.1 鼠和人HO-1的区别 目前HO-1缺失小鼠模型为探讨HO-1在肾IRI中的保护作用提供了非常有利的工具，也有一些研究显示在这些转基因小鼠模型中得到的一些结论与HO-1缺失人群一致。但将HO-1作为肾脏IRI潜在的治疗靶点还是存在很多限制。目前出现的新型动物模型克服了原有模型的限制，例如， Cre-Lox特殊位点重组酶技术动物模型可以在肾近端小管细胞或髓系细胞内缺失或过表达HO-1，该技术能够更深入地分析HO-1与AKI中细胞损伤、炎性反应和修复的关系；“人类化”转基因小鼠的产生，即在小鼠HO-1敲除背景上在调控区增加了人类HO-1的基因，这种模型可以作为一种重要的工具研究人类HO-1基因体内调节及筛选以HO-1为靶点的AKI治疗药物的筛选[21]。

5.2 HO-1和Micro-RNA MiRNAs是一种非编码RNA分子，参与基因沉默和基因表达的转录后调节。在很多肾脏疾病中MiRNAs都起到很关键的作用。MiRNAs调节肾近端小管细胞、内皮细胞等多种细胞中HO-1的基因表达，HO-1的表达也反过来调节MiRNAs，这种互相影响和调节提供了进一步研究急性肾损伤等肾脏疾病作用机制和治疗靶点的创新性平台[22]。

5.3 HO-1的基因多态性 研究显示在HO-1基因的5’端区域存在基因多态性，包含一个(GT)n二核苷酸长度的多态性和2个单核苷酸的多态性G(-1135)A和T(-413)A。其中(GT)n二核苷酸多态性的研究较多，较短的(GT)n(n<27)与更多的HO-1表达和保护作用有关。最新的研究显示，较长的(GT)n能够增加心脏外科手术后患者发生AKI的风险，但关于HO-1基因多态性与肾脏保护作用的关系还需要更深入的研究[23]。

5.4 离子和急性肾损伤 离子为人体所必需，但它同时能够参与氧化还原反应产生氧自由基造成的有害反应。研究显示肾近端小管重链铁蛋白(FtH)缺失可以提高小鼠肾脏中HO-1的表达，加重肾功能损伤及形态学改变。这些研究提示FtH与HO-1诱导的共表达能够安全的吸收血红素降解释放的离子，阻止他们参与还原反应。临床研究证实了这个结论[24,25]。FtH可能会成为治疗AKI中离子吸收的新靶点。

5.5 HO-1作为急性肾损伤的标志物 依赖于传统的血清尿素氮、血清尿肌酐和尿量来诊断AKI已经成为早期诊断和干预治疗AKI的极大障碍。最近的研究更多关注更典型的标志物。Zager等[26]发现在肾脏IRI模型中的HO-1酶被诱导且血浆和尿中的水平升高，且有10个AKI患者血浆和尿液中的HO-1水平远高于正常人或慢性肾疾病患者。其他的研究也证实了HO-1可以作为AKI的标志物。有研究显示尿液中HO-1水平的增加要早于蛋白尿并与肾小球滤过率负相关。除了血肌酐、尿量和蛋白尿之外，HO-1也可以作为一个非常及时的补充诊断AKI的标志物。但是HO-1要作为典型的AKI的标志物还需要解决两个问题：(1)是观察的血浆和尿液中的HO-1是定位在内质网中，这个定位就会引发疑问：到底血浆和尿液中的HO-1仅仅是细胞损伤胞内蛋白释放还是它包含着更积极的细胞分泌途径？(2)血浆和尿液中免疫反应性的HO-1表现为一个16 kDa的蛋白，更像是两个大小相等的环断裂[27]。这种断裂的功能和机制还需要更深入的研究。

过去几十年的研究证实，HO-1在肾脏IRI中有十分重要的保护作用。HO-1在肾脏IRI中被诱导表达，降低或缺失HO-1的表达会加重肾脏结构和功能的损伤，提高HO-1的表达则有保护作用。HO-1的肾脏保护机制多样，包括肾血流改变、免疫调节、氧化应激、细胞凋亡、自噬等。最新的动物模型为研究HO-1在肾脏IRI中的作用提供了有力的工具；血浆和尿液中的HO-1水平可以作为临床诊断AKI的潜在标志物，HO-1启动子的基因多态性与它的肾脏保护作用有关等，因此，HO-1酶系统临床上可以作为治疗急性肾损伤，尤其是肾脏IRI的潜在重要靶点。

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(2017--12-10收稿 2018-01-23修回)

王 涛，硕士，主治医师。

100027,武警北京总队医院外一科

王群锁，E-mail:taow-1979@163.com

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