基于近红外量子点的荧光共振能量转移生物探针构建及应用

修景锐，胡思怡，李金华*，任 升，刘丽炜

(1.长春理工大学 理学院，吉林 长春 130022；2.深圳大学 光电工程学院，广东 深圳 518060)

1 引 言

荧光共振能量转移(FRET)是一种通过荧光物质间发生非辐射能量转移进行分析的光谱分析法[1-2]。自该理论提出以来，FRET已被广泛应用于农业、医药、司法鉴定和科学研究的各个领域中[3-8]。

近年来，FRET技术在空间分辨率、敏感性方面有很大的提高，根据FRET设计的传感器在生物学研究领域得到广泛应用，如检测生物大分子的构象变化、生物大分子之间的相互作用、生物分子间纳米尺度的距离等[9-12]。研究表明能量供受体的光学性质及传感器的组装方法对FRET传感器的检测性能有至关重要的影响[13]，然而传统的能量供受体(如有机荧光染料、生物材料、镧系元素等)由于荧光强度低、光稳定性弱、对环境敏感、生物相容性较差，并且毒性较大，容易受到生物体内自发荧光和杂散光干扰，导致出现荧光强度下降、生物检测达不到预期目标等缺点，从而限制了FRET传感器的发展与应用[14-19]。

目前，南京工业大学课题组[20]将近红外FRET体系应用于光动力治疗方面进行研究，一定程度上改善了可见FRET体系的缺点，达到了更好的治疗效果，但目前近红外FRET体系作为敏感型探针的研究依然比较缺乏。

本文构建了近红外区域的FRET体系，供体为荧光发射峰在近红外的InP/ZnS量子点，受体为吸收在近红外的荧光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)。弥补了传统可见光量子点在生物应用中的缺陷。同时对该体系进行浓度和细胞微环境pH敏感性检测，结果表明FRET体系的荧光强度可直接反映细胞微环境的酸碱度变化，对体系pH值有较高的检测精度，本研究为FRET体系作为敏感型探针应用于癌症早期诊断提供了理论和实验依据。

2 材料与方法

2.1 实验试剂与仪器

实验试剂：醋酸铟(In(Ac)3)，硬脂酸锌(Zn(St)2)，十二烷基硫醇(DDT)，购于Alfa公司；肉豆蔻酸(MA)，购于TCI公司；1-十八烯(ODE)，购自Sigma公司；二硫代苏糖醇(DTT)，磷化锌(Zn3P2)购买于国药上海试剂公司。氢氧化钠，盐酸以上药品均购于国药试剂。荧光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)，购于武汉斯奈德生命科技有限责任公司。实验所用溶剂如不作特殊说明均用超纯水(HPLC),购于Alfa公司。DMEM高糖培养液，其中含有10%的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，100 μg/mL的盘尼西林和100 μg/mL的链霉素，均购于Gibco公司。

实验仪器：高精度电子天平(Sartorius，Quintix224-1cn)，磁力搅拌器加热台(Thermo Scientific，Cimarec)，超声清洗器，恒温水浴箱，移液器，紫外-可见-近红外分光光度计(Agilent，Cary 5000 UV-Vis-NIR)，荧光分光光度计(Agilent，Cary Eclipse)，透射电子显微镜， FLS980超快荧光寿命光谱仪，荧光倒置显微镜(DMI3000，Leica，德国)。

2.2 实验方法

量子点的制备：将0.2 mmol的醋酸铟，0.6 mmol的肉豆蔻酸和15 mL 1-十八烯在氮气保护下保持110 ℃加热1 h，获得In前驱液。将3 mL盐酸(4 M)注入磷化锌，生成的磷化氢气体通入到加热至240 ℃的In前驱液中，获得InP量子点。将0.6 mmol硬脂酸锌溶解于2 mL 1-十八烯中并加热至120 ℃后，将其注入InP量子点溶液中，形成InP/ZnS复合物，最后，将加热至260 ℃的十二烷基硫醇(0.6 mmol)加入InP/ZnS复合物，反应1 h后获得InP/ZnS量子点。

上一步骤中制备了油性的InP/ZnS量子点，我们接下来对油性量子点进行了表面修饰，以便其更好的生物应用，具体修饰方法如下：将1 mL甲醇，1 mL氯仿，4 mL MPA和油性量子点混合搅拌5 min，向搅拌后的混合溶液中加入3%的NH4OH，继续搅拌5 h，获得水溶性InP/ZnS量子点。

FRET体系的构建:将InP/ZnS量子点溶液和Cy7荧光染料摩尔比例1∶0、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.03、1∶0.04和1∶0.05混合加入反应样品瓶中，在常温、常压条件下搅拌5 min，对混合溶液进行测定。

荧光光谱测定：在室温条件下，依次取1 mL的量子点与染料构建FRET体系溶液，以600 nm为激发波长，激发和发射狭缝为5 nm，记录620 nm到850 nm波长范围内的发射光谱变化。

傅里叶红外光谱测定：50 ℃下将InP/ZnS量子点，Cy7荧光染料和FRET体系烘干成粉末状备用。分别将3种待测样品与溴化钾粉末以1∶10的比例混合后充分研磨，将混合后的粉末进行压片处理，获得待测样品。

MCF-7乳腺癌细胞荧光成像：用于荧光成像的MCF-7乳腺癌细胞在使用前要分种在6孔培养板中。实验前的细胞需培养24 h，密度在60%～70%即可。用于荧光成像的FRET体系样品按照10～20 μg/mL的浓度溶于PBS中(pH=7.2)。向六孔板的每个孔中加入20～40 μL的样品，轻轻摇匀后，在37 ℃，5%CO2环境下培养4 h后，移去培养液，用PBS清洗3遍，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态并进行荧光成像研究。

3 结果与讨论

3.1 InP/ZnS量子点-Cy7荧光染料FRET体系的构建

由图1可知，InP/ZnS量子点的发射光谱与Cy7染料的吸收光谱有较大的重叠面积，图中的阴影部分为重叠部分。而InP/ZnS量子点的发射光谱与染料的发射光谱相距较远，最大发射峰值相差60 nm，有效避免了供受体之间的荧光干扰。所以InP/ZnS量子点和Cy7荧光染料符合构建FRET体系的基本条件[21-22]，其中InP/ZnS量子点和Cy7染料分别作为FRET体系的供体和受体。

图1 InP/ZnS量子点和Cy7荧光染料的吸收和发射光谱对比图 Fig.1 Comparison of absorption and emission spectra of InP/ZnS quantum dots and Cy7 fluorescent dyes

根据实验室经验，供体InP/ZnS量子点表面游离的羧基(—COOH)能与受体染料Cy7表面游离的氨基(—NH2)通过化学键和的方式相连接，以拉近供受体之间的距离。为了验证该结论，我们利用傅里叶红外光谱测试(FTIR)对InP/ZnS量子点与染料Cy7之间化学键合的情况进行验证。在图2中，InP/ZnS量子点溶液在1 650 cm-1(COO—)处有振动峰的存在，Cy7染料在3 438 cm-1(NH2)处有振动峰存在。供体InP/ZnS量子点与受体Cy7染料的结合是通过Cy7上的—NH2和量子点表面的—COOH(来自于量子点的表面修饰剂MPA)，脱水缩合形成的肽键(—CO—NH—)。图2中曲线1代表了InP/ZnS量子点和Cy7染料构建的FRET体系，InP/ZnS-Cy7染料在1 576 cm-1(—CO—NH—)处的振动峰存在，确定了两种样品成功结合，这个1 576 cm-1的振动峰在InP/ZnS量子点和Cy7单独的红外光谱中均不存在。而且，伴随着1 576 cm-1(—CO—NH—)的出现InP/ZnS量子点上的1 650 cm-1(COO—)振动峰明显减弱，这进一步确认了InP/ZnS量子点与Cy7染料之间的化学键合过程的成功实现。

图2 InP/ZnS量子点，Cy7，FRET体系的FTIR光谱 Fig.2 FTIR spectra of InP/ZnS quantum dots, Cy7 fluorescent dyes and FRET system

3.2 InP/ZnS量子点和Cy7染料浓度对FRET体系的影响

不同浓度的InP/ZnS量子点与Cy7染料构建FRET体系。如图3(a)所示，当Cy7染料浓度不变时，随着量子点浓度的增加(0.1～0.5 μmol/L)，Cy7染料的荧光强度会明显增强，可以看出量子点与染料之间发生了荧光共振能量转移。随着供体InP/ZnS量子点浓度的增加，FRET体系的荧光共振能量转移效率逐渐减小，如图3(b)所示，这是因为随着供体分子数量的增多，围绕在单个供体附近的受体分子平均数目减少，体系的荧光共振能量转移效率减少。本论文转移效率是基于荧光强度计算的，Styrer和Haugland 给出[23]，同理，保持量子点浓度不变，改变Cy7染料的浓度，获得FRET体系的变化情况如图4所示。从图4(a)中可以看出，随着Cy7染料浓度的增加，量子点的荧光强度随之减小。通过公式(1)，计算得到了改变Cy7染料后的荧光共振能量转移效率，如图4(b)所示。从图4(b)中可以看出，随着受体浓度的增加，FRET体系能量转移效率逐渐增大，但当QDs:Cy7小于1:250后，荧光共振能量转移效率达到最大，因为当Cy7染料浓度增加到一定程度时，量子点周围围绕的受体染料分子供数目达到饱和。

(1)

式中，ID-A、ID分别代表有受体和无受体时供体的荧光强度。这样，通过测量供体的荧光强度可以计算出荧光共振能量转移的效率E。

图3 改变InP/ZnS量子点浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率 Fig.3 FRET system when the InP / ZnS quantum dot concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency

图4 改变Cy7浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率 Fig.4 FRET system when the Cy7 concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency

3.3 pH值对FRET体系的影响

如图5所示，将Cy7染料和InP/ZnS量子点分别溶在pH值为4、7、10、12的去离子水中进行荧光光谱的测试。从图5(a)中可以看出，随着溶液pH值从4升至12，溶液中染料的荧光强度没有明显的改变，可以说明染料本身对pH值不敏感。但从图5(b)可以明显看出，随着溶液pH值的改变，量子点的荧光强度有明显的变化，强酸性条件下，量子点的荧光强度最弱，这是因为溶液中较为丰富的H+抑制了量子点表面羧基的解离。相反当溶液偏碱性时，其中会有含有丰富的OH-，能够促进羧基的解离，但过高的pH值同样会降低量子点的荧光。

图5 Cy7(a)和InP/ZnS量子点(b)在不同pH值溶液中的荧光光谱图 Fig.5 Fluorescence spectra of Cy7(a) and InP/ZnS quantum dots(b) in different pH solutions

测试了供受体对pH值的响应之后，通过调节FRET体系(InP/ZnS-Cy7)的pH值，验证该体系的对pH值的敏感性。癌细胞形成初期表现是pH值的微弱改变，因此，本文拟利用自行构建的FRET体系对pH值的敏感性实现对不同pH值缓冲液的监测，最终应用于癌细胞微环境检测，实现癌症早期诊断。如图5所示，验证了pH值的微弱改变(pH=6.7～9.1)对体系的荧光强度的影响。在一定范围内，pH值的降低，体系的荧光强度逐渐减弱，呈现出明显趋势，实验结果表明该体系可以作为pH值敏感型生物探针。

图6 FRET体系在不同pH值溶液中的荧光光谱图 Fig.6 Fluorescence spectra of FRET system in different pH solutions

3.4 FRET体系对生物微环境检测的应用

为了验证InP/ZnS-Cy7体系生物应用的可行性，首先采用MTT比色分析法对体系的细胞毒性进行测试，具体测试过程如下：

利用96孔板培养MCF-7乳腺癌细胞，FRET体系按照浓度梯度为4、2、1、0.5和0.25 nmol/mL溶解，向孔中分别加入不同浓度的待测样品，摇匀后置于CO2培养箱(37 ℃)中培养24 h，确保样品进入细胞并对细胞产生作用。24 h后，取出含有样品的96孔板，向每个孔中加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL，摇匀后再培养4 h，活细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒。抽取孔上层溶液后加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO，购于Sigma)，利用酶标仪在495 nm处对其进行扫描，得到细胞活性数据。如图7所示，24 h后，随着InP/ZnS-Cy7体系浓度的增加，细胞活性虽然有所降低，但总体细胞活性均保持在60%以上，具有良好的生物兼容性，可以进行相关的生物研究和应用。

图7 FRET体系的细胞毒性测试 Fig.7 Relative cell viability of MCF-7 breast cancer cell treated with FRET system

为了证明该体系可以作为荧光探针对生物微环境进行检测，便于未来应用于癌症的早期诊断研究中。我们应用所构建的近红外荧光探针对不同的细胞微环境进行了检测，分别采用高糖培养基(DMEM)、50%密度的巨噬细胞(RAW 264.7)培养48 h后的含有代谢产物的细胞外液、50%密度的MCF-7乳腺癌细胞培养48 h后的含有代谢产物的细胞外液作为检测溶液，测试所获的荧光光谱如图8所示。可以明显看到，探针的荧光随着细胞外液酸碱度的变化而产生明显变化，通过与精确pH试纸(MN,MACHEREY-NAGEL,德国)比对，该FRET体系对细胞微环境pH值检测精度可达到0.1，在乳腺癌细胞外液中的FRET体系的荧光强度最弱。

图8 FRET体系对不同细胞微环境的检测 Fig.8 Detection result of different cell microenvironment by FRET system

量子点良好的荧光信号决定了所构建的FRET体系除了能够实现癌细胞的pH值敏感度检测外，还能够实现癌细胞的荧光标记。图9显示了FRET体系对MCF-7乳腺癌细胞的成像实验。从明场图像可以看出对照组和实验组细胞生长状态良好，细胞形态正常，呈不规则多边形，没有发现细胞形态的变化，或细胞壁破损的情况，说明该FRET体系毒性较低。通过暗场荧光图可以看出，相比对照组，实验组的细胞内具有来自于FRET体系的明显荧光信号，证明该FRET体系可作为荧光探针对乳腺癌进行荧光标记。

图9 FRET体系对MCF-7乳腺癌细胞的荧光标记 Fig.9 Fluorescently label in MCF-7 breast cancer cells by FRET system

4 结 论

本文采用近红外InP/ZnS量子点与近红外Cy7染料构建FRET体系，通过改变体系中量子点和Cy7染料的浓度对FRET体系转移效率的影响进行了讨论分析。最后，研究了不同pH值溶液对FRET体系的影响，结果显示Cy7染料本身对pH值并不敏感，FRET体系对pH值的敏感性主要源于量子点对pH值的敏感性，当溶液pH值处在7～10时，FRET体系具有较高的FRET转移效率。细胞测试结果表明，FRET探针的荧光信号随着细胞外液酸碱度的变化而产生明显变化，可用于生物微环境中对癌细胞的检测。同时，乳腺癌细胞外液中的FRET体系的明显荧光信号可以应用于癌细胞成像，实现了FRET体系的双重功能。

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