p53蛋白在电针预处理改善急性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能中的作用①

李雪静，唐强，叶涛，朱路文，吴佳佳，尹侠，秦萍，赵晓倩

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001；3.上海中医药大学，上海市201203

脑卒中是单病种致残率最高的疾病，其中以缺血性脑卒中发病率最高，且发病趋势愈加年轻化。近20年来心肌梗死的发病率已经下降3%～5%，而脑卒中的发病率却上升50%[1]，严重影响人类健康和生活。

通过预处理的方式诱发脑缺血耐受，从而在损伤来临时起到保护作用，这一方法为缺血性卒中的防治提供了启发[2]。临床上可以作为预处理的手段很多，如缺血、浅低温、高压氧、化学药物、睡眠夺获、皮质扩散抑制等。电针作为临床治疗的常用且有效的手段，其脑保护作用受到越来越多的重视，并应用于临床及围手术期。电针预处理可以明显抑制自噬，减少凋亡，改善再灌注后的神经功能损伤[3]。Li等[4]证实p53蛋白以及相关信号通路参与调节脑缺血再灌注损伤时细胞的自噬及凋亡。

本实验通过观察电针预处理对模型大鼠脑缺血再灌注损伤区域p-p53(ser392)、p53、微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ蛋白的表达情况，探讨其脑保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠72只，体质量220～240 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号SCXK-黑-2010007。饲养环境：室内温度24～26℃；空气湿度60%～70%、环境噪音＜60 dB，明暗各12 h交替(7:00～19:00开灯)。

1.2 主要仪器和试剂

G6805-1A型电针仪：上海华谊医用仪器有限公司。DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪、DYCZ-40D型转印电泳仪：北京六一仪器厂。RM2235型切片机：德国LEICA公司。Peri Flux 5000型激光多普勒血流仪：瑞典PERIMED公司。TUNEL试剂盒：德国ROCHE公司。一次性无菌针灸针：东邦牌。

p53、LC3、β-actin抗体：沈阳WANLEIBIO公司。p-p53(ser392)：英国ABCAM公司。四甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetrameth-ylethylene-diamine,TEMED)：美国AMRESCO公司。羊抗兔IgG-HRP：中国BEYOTIME公司。预染蛋白分子量标准：加拿大FERMENTAS公司。PVDF膜：美国MILLIPORE公司。

1.3 动物分组及干预

编号设置：将72只实验大鼠编号，计算机生成包括72个数的随机数字表，列表中的第一个数字即为1号(对应大鼠号码)，按照从左到右，自上而下的顺序分别编号1～72号大鼠。

组别设置：从列表中任意挑选一随机数字除以3，余数为0、1、2分别对应假手术组、模型组、电针预处理组，最终各组随机分入24只大鼠。用同样方法将各组24只大鼠随机分入2 h、72 h两个亚型组，每组12只。

假手术组大鼠与电针预处理组干预方法基本相同，但在造模时仅切开皮肤，剥离动脉，然后缝合；模型组进行大脑中动脉梗死造模，但无预处理措施；电针预处理组在进行预处理措施(电针)2周后进行造模。

1.3.1 电针预处理

固定大鼠，根据《实验动物图谱》选取大鼠百会穴(双耳前缘连线中点)，采用1寸东邦针灸针(直径0.25 mm，长25 mm)以45°进针深约2 mm，连接电针仪(一端连接针，另一端连接大鼠耳尖)，频率2/15 Hz，强度1 mA，疏密波，以耳尖微动而无明显躁动为准，时间30 min，每天1次，每周5 d，共2周。

1.3.2 模型制备

术前12 h禁食，不禁水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定于恒温加热板。用碘伏将大鼠颈部环形消毒，颈正中切口，钝性剥离各层组织，暴露各动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉处的下方剪一“V”型切口，插线栓，深度大致为距离分叉处约16～17 mm。查看大脑中动脉脑血流基线值，如果在30%以下则视为造模成功。结扎颈内动脉，留出适当长度线栓以备造模后2 h拔除所用。

假手术组不结扎和插栓，仅切开后予以缝合。

1.4 指标检测

1.4.1 神经行为学评估

分别于再灌注后2 h、72 h采用改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)对所有大鼠进行神经行为学评估。总分14分，轻度损伤1～4分，中度损伤5～9分，重度损伤10～14分。

1.4.2 取材

所有大鼠神经行为学评估后，分别于再灌注后2 h、72 h从各组抽取6只大鼠做心脏灌注：10%水合氯醛5.0 ml/kg腹腔注射深度麻醉大鼠后暴露心脏，以灌注针从心尖快速灌注生理盐水100 ml，后继续灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液200 ml直至大鼠躯干发硬。断头取脑组织，以视交叉处为切开点将脑组织冠状切开，向后取约6 mm，常规处理后制备5μm薄片，贴片后留存。

1.4.3 HE染色

石蜡切片60℃烘烤2 h，二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇溶液水合，蒸馏水浸泡2 min，苏木素浸泡5 min，蒸馏水浸泡5 min，1%盐酸酒精分化3 s，自来水洗20 min，蒸馏水浸泡2 min，伊红染液浸泡3 min。上行梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下拍照观察。

1.4.4 TUNEL染色

取上述石蜡切片，常规处理后行连续冠状切片，厚3～5μm，烤片后保存。烤片、脱蜡、水合、PBS漂洗；滴加TUNEL反应液约50μl，孵育1 h，PBS漂洗；滴加POD反应液约50μl，孵育30 min，PBS漂洗；显色、PBS漂洗、染色，温水返蓝。脱水、透明、封片、镜检。每只大鼠取1张切片，低倍镜(10×10)下定位脑梗死灶周边顶叶皮质区，高倍镜(10×40)下观察不重叠3个视野并采图，采用Image Pro Plus 6.0对TUNEL阳性细胞进行计数，以3个视野下的均值作为该样本凋亡细胞数。

1.4.5 Western blotting

再灌注后2 h、72 h，神经行为学评估后，各组抽取6只大鼠，10%水合氯醛5.0 ml/kg腹腔注射深度麻醉大鼠。麻醉大鼠断头取脑后切取缺血侧脑组织，放入液氮中冻存，留待Western blotting检测。

取梗死区周边脑组织40 mg，加入裂解液，离心机将脑组织离心，提取蛋白质。0.5μg/μl BSA蛋白标准液配以PBS缓冲液至酶标板，每孔20μl，绘制标准曲线，计算样本蛋白浓度。将待测样本蛋白抽提物1μl与PBS缓冲液19μl混匀制备蛋白质待测液。调至最大电流，在80 V电压下，进行恒压电泳2.5 h。转印1.5 h、封闭，摇床进行慢速摇动约1 h。加入p-p53(1∶1000)、p53(1∶500)、LC3(1∶500)一抗，4 ℃孵育过夜，拿出PVDF膜，TTBS反复冲洗4次，每次持续5 min；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃孵育45 min。加入ECL发光液，进行ECL底物发光，静置5 min，曝光。内参β-action稀释比1∶1000，检测过程同一抗。扫描胶片，采用Quantity One进行半定量分析，以目的蛋白灰度值与内参β-action蛋白灰度值比值为该蛋白的相对表达量，随机选定假手术组某一样本蛋白相对表达量为1，余样本均为与其较正后的相对表达量，各组平行检测6个样本，求得各组目的蛋白平均表达水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计处理。计量资料采用(xˉ±s)表示，三组间比较采用ANOVA方差分析，两两比较采用LSD-t检测。显著性水平ɑ=0.05。

2 结果

2.1 mNSS评分

再灌注2 h、72 h后，假手术组无明显神经功能缺损。与假手术组相比，同一时间点模型组的mNSS评分均升高(P＜0.05)。与模型组比较，电针预处理组再灌注72 h mNSS评分降低(P＜0.05)。见表1。

2.2 HE染色

再灌注2 h、72 h，光镜下假手术组神经元形态正常，胞核大而规整，核膜、核仁清晰可见，微血管周围间隙正常。与假手术组相比，模型组、电针预处理组正常神经元数量减少，深染色神经元数量较多，其中模型组神经元变性更明显，间质水肿更严重。见图1。

2.3 TUNEL染色

再灌注2 h、72 h，假手术组有少量的凋亡细胞，即细胞核内可见到较为显著的棕黄色颗粒或者小斑片。模型组与假手术组相比，同一时间点凋亡细胞数目增加(P＜0.05)。电针预处理组与模型组相比，再灌注72 h凋亡细胞数减少(P＜0.05)。见表2、图2。

2.4 Western blotting检测

再灌注2 h、72 h，与假手术组比较，同一时间点模型组p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白表达均升高(P＜0.05)。与模型组比较，再灌注2 h电针预处理组p-p53、LC3Ⅱ蛋白表达均降低(P＜0.05)，p53表达无显著性差异(P＞0.05)；再灌注72 h，电针预处理组p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白表达均降低(P＜0.05)。见表3、图3、图4。

图1 再灌注2 h、72 h各组大鼠缺血侧神经元(HE染色，bar=50μm)

图2 再灌注2 h、72 h各组大鼠TUNEL阳性细胞表达结果(TUNEL染色，bar=50μm)

表1 再灌注2 h、72 h各组mNSS评分

表2 再灌注2 h、72 h各组TUNEL阳性细胞数(/HD)

表3 再灌注2 h、72 h各组p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白水平(相对表达量)

图3 再灌注2 h、72 h各组大鼠p-p53、p53蛋白表达

图4 再灌注2 h、72 h各组大鼠LC3Ⅱ蛋白表达

3 讨论

缺血性脑卒中再灌注时间与预后成正相关，再灌注每延长半小时，3个月良性预后率可能下降12%[5]。再灌注可以有效恢复脑组织血液供应，是减少损伤和神经功能缺损的重要措施，但在恢复过程中易引起离子动态平衡紊乱和脑能量障碍，从而启动“瀑布式”级联损伤反应，造成脑组织再次损伤，即缺血再灌注损伤。

Janoffd等1964年提出缺血耐受的概念，随后的30年时间内人们相继在心脏、脑、肾脏等器官中发现，短暂的一次或重复缺血后，可以增强器官对缺血的耐受能力，以应对再次损伤，并将之称为缺血预处理[6]。预处理可以归结于中医“治未病”范畴，体现了“预防为主”的医学思想。其潜在的机制可能涉及兴奋性或抑制性神经递质、炎症因子、腺苷、信号通路转导、细胞凋亡、DNA自我修复/重塑机制、内质网应激等[7-10]。在脑缺血之前给予电针刺激，诱导脑组织细胞对抗脑缺血缺氧而产生耐受，从而对随后发生缺血的脑组织产生部分保护作用的处理措施，称为电针预处理[11]。

电针是康复医学科、针灸科、中医科在临床上治疗疾病的常用手段。多项研究表明，电针预处理不仅可以有效减轻缺血再灌注损伤，在缺血发生后给予电针治疗同样能够发挥保护作用[12]。以往的研究结果表明，常用于脑保护的穴位主要有百会、大椎、委中、肾腧及足三里等[13-15]。虽然这些穴位都具有一定的脑保护作用，但是中医经络学理论表明，邻近器官的穴位具有治疗效果的特异性，且也有人应用功能磁共振成像证明了邻近选穴的优势[16]。

百会穴位于人体督脉之巅，位于躯体运动和感觉皮层的体表投射区，接近Wills环，临床常用于预防和治疗脑部疾病。我们前期进行的研究也表明，电针预处理百会穴可以有效减弱大脑缺血再灌注损伤后的炎性反应发生，抑制坏死区域及周边组织细胞凋亡，诱导脑缺血耐受的发生，具有神经保护作用[17]。

脑缺血预处理的保护机制目前没有全面阐明，现有的研究都表明该机制与许多复杂因素有关，其中细胞的凋亡和自噬是研究的热点。凋亡发生的速度和凋亡神经元的数量决定着缺血引起损害的范围[18]。自噬本身是一种蛋白质降解的代偿机制(或防御机制)，可以加快细胞内大分子物质的循环，增强细胞对环境变化的耐受能力。二者功能不同，但又通过特定的条件相互关联，在疾病发展的不同阶段发挥各自作用，呈动态改变[19]。

p53是抑癌基因，组织缺氧、细胞损伤或癌细胞活化等应激变化，均可诱导p53激活；被激活的p53蛋白通过调节细胞周期，调控细胞分化和促进细胞凋亡等[20]。Sung等[21]的研究发现，p53也参与机体缺血缺氧时自噬机制的调节。Kotulska等[22]发现缺血小鼠模型的海马C1区域以及皮质中的自噬表达增加，可明显减轻损伤神经元的坏死。但也有研究[23]发现，阻断自噬后可以减少大鼠脑缺血的梗死范围以及脑水肿严重程度。综合来看，自噬应该具有双重作用，且和一种自噬标志蛋白ATG8募集有关。当机体面临“可处理”的刺激时，ATG8会被募集到自噬泡中，促进自噬对受损细胞的修复；但当这种不良刺激增大到“不可控”的损伤阈值时，细胞就进入凋亡通路[24]。p53蛋白同样有双面作用，因其胞内的定位不同而作用不同。当其出现在胞核内时是促进自噬，而在胞质中却有相反作用，多与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号转导通路相关[25]。

本研究结果显示，脑缺血再灌注72 h，TUNEL法观察到凋亡细胞数多于再灌注2 h，说明急性再灌注期间细胞凋亡呈加重趋势；LC3Ⅱ作为自噬标志蛋白，于脑缺血再灌注2 h、72 h其表达呈升高趋势；HE染色显示，脑缺血再灌注72 h缺血侧脑损伤程度明显重于再灌注2 h，提示急性再灌注期间脑损伤程度的加重与细胞凋亡的增加、自噬的过度增强密切相关。电针预处理组大鼠于再灌注2 h、72 h，缺血侧脑损伤程度明显改善，缺血半暗区细胞凋亡数明显降低，自噬水平降低，说明电针预处理可以诱导脑缺血耐受，抑制脑缺血再灌注期间细胞凋亡，调节自噬水平，改善神经功能缺损，发挥脑保护作用。再灌注2 h、72 h，模型组p-p53、p53表达明显升高，说明p53蛋白参与急性脑缺血再灌注期间病理过程；电针预处理组p-p53、p53表达较模型组有下降趋势，提示电针预处理可以调控p53蛋白参与电针预处理的脑保护过程。值得一提的是，再灌注2 h，电针预处理组p53蛋白水平较模型组比较差异无统计学意义。既往研究显示，胞核p53是mTOR的上游介导蛋白，可以抑制mTOR表达，减弱mTOR对自噬相关蛋白ULK-1、Beclin1、DRAM表达的抑制作用，增强自噬。胞质p53可以抑制Bcl-2表达，促进细胞凋亡出现[26]。再灌注2 h，电针预处理组p53蛋白较模型组无明显降低，究其原因可能与胞内的不同定位p53蛋白作用不同及表达差异有关，具体的调控机制有待进一步阐明。

综上所述，重复电针预处理百会穴可以改善大鼠急性脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损，降低缺血侧脑损伤程度，发挥脑保护作用，其机制可能与调控p53蛋白影响急性脑缺血再灌注期间自噬及凋亡有关。我们后期将考察电针预处理是如何通过p53/mTOR通路进行脑缺血再灌注损伤调节脑保护作用的具体机制。

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