培养条件和果汁种类 对脂环酸芽孢杆菌生长的影响

白 淼,张 灿,*,张明露,史 云,王莉莉,戚丽华

(1.中国人民解放军疾病预防控制所,北京 100071;2.北京工商大学环境科学与工程系,北京 100048;3.中国人民解放军陆军总医院,北京 100700)

脂环酸芽孢杆菌是造成巴氏灭菌果汁腐败的重要细菌之一,具有嗜酸、耐热、产芽孢等特征。脂环酸芽孢杆菌的芽孢具有很强的抗逆性,常用的果汁灭菌措施如巴氏灭菌难以将其有效灭活。1984年Cerny首次从腐败果汁中分离出脂环酸芽孢杆菌[1],此后国内外有关脂环酸芽孢杆菌的研究逐年增多,目前已经受到果汁饮品行业的重点关注。脂环酸芽孢杆菌属于非致病菌[2],但是其具有“烟熏味”和“药味”的代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚,在极低浓度条件下就会严重影响果汁风味[3]。近年来,多个国家相继发生脂环酸芽孢杆菌引发的巴氏灭菌果汁腐败事件。Oteiza报道阿根廷采集到的果蔬汁样品中,脂环酸芽孢杆菌阳性样品检出率为24%～100%[4]。加纳和尼日利亚的225份果汁样品中,有26份(11.6%)样品脂环酸芽孢杆菌的检测结果呈阳性[5]。从脂环酸芽孢杆菌污染途径来看,土壤是其主要来源,生产果汁所用的原料果表面一旦被污染,在后续的生产环节中难以将其彻底去除,容易引发果汁腐败[6]。

表1 培养基成分[8-9]Table 1 Ingredients of different media[8-9]

注:*微量元素溶液:CaCl2·2H2O 0.66 g/L,ZnSO4·7H2O 0.18 g/L,CuSO4·5H2O 0.16 g/L,MnSO4·4H2O 0.15 g/L,CoCl2·6H2O 0.18 g/L,H3BO30.10 g/L,NaMoO4·2H2O 0.30 g/L。

目前国内外还没有确定脂环酸芽孢杆菌的标准培养基,培养条件也没有统一规定。此外,脂环酸芽孢杆菌在不同种类果汁中的生长情况和代谢产物的释放特征也不明确。本文研究pH以及不同种类的培养基和果汁对脂环酸芽孢杆菌生长的影响,旨在进一步优化脂环酸芽孢杆菌的检测方法,为果汁中脂环酸芽孢杆菌污染的防控和果汁品质质量的提高提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脂环酸芽孢杆菌 从市售橙汁产品中分离得到,采用通用引物27F/1492R进行扩增,引物序列为27F:AGAGTTTGATYMTGGCTCAG;1492R:GGTTACC TTGTTACGACTT[7]，通过16S rDNA序列分析及BLAST比对,该菌与A.acidocaldariusATCC 43030的相似度达99%,确定分离菌株属于Alicyclobacillus属;菠萝汁、橙汁、番茄汁、梨汁、苹果-葡萄汁、苹果汁、葡萄汁、桃汁和西柚汁 均为国产和进口的市售果汁产品,处于保质期内的100%纯果汁,不含任何防腐剂;Yeast Starch Glucose(YSG)培养基、Bacillusacidoterrestristhermophilic(BAT)培养基、Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)培养基、K氏培养基和SK培养基的成分见表1;马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)和营养肉汤培养基 购买自当地试剂公司;愈创木酚标准品 纯度为99.9%,TRC公司,加拿大;2,6-二溴苯酚标准品 纯度为99.9%,SUPELCO公司,美国。

7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 Agilent公司,美国;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、萃取瓶和固相微萃取装置 SUPELCO公司,美国;纯水仪 Thermo公司,美国;数显恒温磁力搅拌器、超净工作台、台式pH计、恒温培养箱、恒温摇床、涡旋振荡器等。

1.2 实验方法

1.2.1 脂环酸芽孢杆菌计数 采用无菌生理盐水将待测菌液按1∶10进行梯度稀释,涂布于BAT固体培养基,置于42 ℃恒温培养箱中培养4 d后计数。

1.2.2 愈创木酚和2,6-二溴苯酚的检测 采用固相微萃取(SPME)和气相色谱(GC)-质谱(MS)技术检测果汁中脂环酸芽孢杆菌的代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚,具体方法参照文献[10]。

1.2.3 pH对脂环酸芽孢杆菌生长的影响 将浓度为2.2×103CFU/mL的脂环酸芽孢杆菌新鲜菌液接种到pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的100 mL BAT液体培养基中,置于45 ℃恒温水浴摇床中培养2 d后计数。

1.2.4 培养基种类对脂环酸芽孢杆菌生长的影响 将浓度为1.7×102CFU/mL的脂环酸芽孢杆菌新鲜菌液分别接种到100 mL的BAT培养基、YSG培养基、AAM培养基、K氏培养基、SK培养基、PDB培养基和营养肉汤培养基中,根据1.2.3的实验结果确定培养基的pH为4.0,置于45 ℃恒温水浴摇床中培养2 d后计数。

1.2.5 果汁种类对脂环酸芽孢杆菌生长的影响 将浓度为4.5×102CFU/mL的脂环酸芽孢杆菌新鲜菌液分别接种到100 mL的9种果汁中,分别为菠萝汁(pH3.5)、橙汁(pH3.7)、番茄汁(pH4.3)、梨汁(pH3.3)、苹果-葡萄汁(pH3.4)、苹果汁(pH3.6)、葡萄汁(pH3.1)、桃汁(pH4.0)和西柚汁(pH3.0),置于45 ℃恒温水浴摇床中培养20 d后,对果汁中脂环酸芽孢杆菌进行计数,并采用SPME-GC-MS检测脂环酸芽孢杆菌代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚。

1.3 数据处理

使用SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 pH对脂环酸芽孢杆菌生长的影响

图1为脂环酸芽孢杆菌在不同pH(BAT液体培养基)下的生长情况。结果表明脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸性,在pH4.0时生长情况最好,细菌数量达到7.9×104CFU/mL。在强酸性(pH2.5)条件下生长较差,细菌数量为9.5×103CFU/mL,偏中性条件(pH6.0～7.0)下生长情况最差,细菌数量级仅在102CFU/mL左右。因此,脂环酸芽孢杆菌生长的pH应该控制在pH3.0～5.0之间,最好是pH4.0左右。脂环酸芽孢杆菌能够在pH较低的环境下生存,可能与其细胞膜上特有的ω-环状脂肪酸有关[11]。ω-环状脂肪酸相当于一个保护层,能够帮助它抵抗高温和酸性的恶劣环境。袁亚宏等[12]对脂环酸芽孢杆菌的生长特性进行研究,发现其在pH2.0～7.0的范围内均可生长,最适生长pH为4.0,这与本文的结果基本一致。

图1 不同pH对脂环酸芽孢杆菌生长的影响Fig.1 Effects of pH on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.2 培养基种类对脂环酸芽孢杆菌生长的影响

由图2可知,培养基种类对脂环酸芽孢杆菌的生长影响较大。其中脂环酸芽孢杆菌在AAM培养基和BAT培养基中生长情况最好,K氏培养基、SK培养基和YSG培养基次之,PDB培养基较差,营养肉汤培养基最差。脂环酸芽孢杆菌在AAM培养基中的数量达到3.1×105CFU/mL,在BAT培养基中略少,为1.8×105CFU/mL。脂环酸芽孢杆菌在营养肉汤培养基中生长缓慢(4.2×103CFU/mL),与AAM培养基和BAT培养基中的细菌数量相比,相差了两个数量级。图2表明,AAM培养基和BAT培养基与其他培养基相比,更适合用来培养脂环酸芽孢杆菌。目前用于培养脂环酸芽孢杆菌的培养基和培养条件尚未统一规定。Goto比较脂环酸芽孢杆菌在BAT培养基和YSG培养基上的生长情况,发现营养细胞没有任何明显区别,但芽孢在YSG培养基中的生长情况要明显强于BAT培养基[13]。Walls报道脂环酸芽孢杆菌在K氏培养基上的生长情况要好于PDA培养基,这与本文的结果相同[14]。Chang认为相对于K氏培养基和PDA培养基来说,SK培养基更适合脂环酸芽孢杆菌的生长,效果由好到差依次是SK培养基>PDA培养基>K氏培养基[15]。Baumgart建议使用PDA培养基(pH3.5)培养脂环酸芽孢杆菌[16]。目前各个机构组织也给出了不同建议,如美国公共卫生协会(APHA)建议采用K氏培养基[17];日本果汁协会(JFJA)建议使用YSG培养基用于该菌的分离[18];国际果汁生产商联合会(IFU)在2007年对果汁中脂环酸芽孢杆菌的相关检测方法进行了重新修订,建议将K氏培养基(pH3.7)与BAT培养基(pH4.0)或YSG培养基(pH3.7)结合使用[19]。

图2 培养基种类对脂环酸芽孢杆菌生长的影响Fig.2 Effects of media on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.3 果汁种类对脂环酸芽孢杆菌生长及代谢产物的影响

图3表明脂环酸芽孢杆菌在不同种类的果汁中生长差异明显,在葡萄汁中的生长情况最好,细菌数量为1.5×104CFU/mL;其次是橙汁,细菌数量为8.5×103CFU/mL。在番茄汁、苹果汁、苹果-葡萄汁、桃汁和梨汁中的生长情况相近(103CFU/mL)。但是,在菠萝汁和西柚汁中生长缓慢,细菌数量分别为4.4×102CFU/mL和1.9×102CFU/mL。Spllttstoesser[20]报道橙汁和梨汁最有利于脂环酸芽孢杆菌的生长,其次是苹果汁、桃汁和白葡萄汁,柚子汁中生长最慢,这与本文的结果基本一致。果汁中的主要营养成分如矿质元素(钾、镁和钙等)、蔗糖以及柠檬酸等会对脂环酸芽孢杆菌的生长产生一定影响。不同种类果汁中的各营养成分含量有所差别,这很可能是造成脂环酸芽孢杆菌在不同果汁中的生长产生明显差异的原因之一。

图3 果汁种类对脂环酸芽孢杆菌生长的影响 Fig.3 Effects of different juices on the growth characteristics of Alicyclobacillus

本研究同时检测了果汁中脂环酸芽孢杆菌的代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚,结果见图3。在未接种脂环酸芽孢杆菌的空白对照组中,9种果汁均未检测出愈创木酚和2,6-二溴苯酚。接种脂环酸芽孢杆菌的9种果汁培养20 d后均未检测出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8种果汁均检测出愈创木酚(8.6～23.9 μg/L)。这表明脂环酸芽孢杆菌污染过的果汁,愈创木酚可能是影响果汁风味更常见的代谢产物。据前期报道[21],在24份市售果汁产品中愈创木酚检出率为33.3%(8/24),浓度最高可达26.9 μg/L,而2,6-二溴苯酚检出率为0%(0/24),这与本文的结果基本一致。

对果汁中脂环酸芽孢杆菌的数量和愈创木酚的浓度进行Pearson相关分析,结果表明r=-0.496,p=0.175>0.05，相关性不具有统计学意义,因此尚不能认为二者存在相关性。如图3所示,葡萄汁中并未检测出愈创木酚,但是细菌数量却高达1.5×104CFU/mL;菠萝汁中检测出的愈创木酚浓度最高(23.9 μg/L),但是细菌数量却仅有4.4×102CFU/mL,远远低于其他几种果汁。据报道,果汁中愈创木酚的释放量除了与脂环酸芽孢杆菌初始数量有关外,也与培养温度、热冲击条件、果汁类型、顶部可利用空间、氧气等多种因素相关[22]。此外,香草醛、香草酸和阿魏酸是微生物代谢产生愈创木酚的前体物质,它们在果汁中的含量也会影响愈创木酚的释放。

3 结论

脂环酸芽孢杆菌在pH4.0时生长情况最好,7种常见培养基中AAM培养基和BAT培养基更适合用来培养该细菌。脂环酸芽孢杆菌在不同种类果汁中生长差异明显,在葡萄汁和橙汁中的生长情况最好,菠萝汁和西柚汁中较差。接种了脂环酸芽孢杆菌的9种果汁中均未检测出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8种果汁中均检测出愈创木酚,浓度范围在8.6～23.9 μg/L之间。这说明脂环酸芽孢杆菌污染过的果汁中,较2,6-二溴苯酚而言,愈创木酚检出率高,因此对果汁风味的影响更大。在今后的研究中,需要进一步完善和优化脂环酸芽孢杆菌的培养条件和方法,探索高效准确的检测手段及控制方法,为提高果汁品质提供参考。

[1]Cerny G,Hennlich W,Poralla K. Spoilage of fruit juice by bacilli:isolation and characterization of the spoiling microorganisms[J]. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung,1984,179(3):224-227.

[2]Walls I,Chuyate R. Spoilage of fruit juices byAlicyclobacillusacidoterrestris[J]. Food Australia,2000,52(7):286-288.

[3]胡贻椿,岳田利,袁亚宏,等. 果汁中脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusspp.)的危害及其控制[J]. 食品科学,2008,29(1):364-368.

[4]Oteiza JM,Ares G,Sant’Ana AS,et al. Use of a multivariate approach to assess the incidence ofAlicyclobacillusspp. in concentrate fruit juices marketed in Argentina:Results of a 14-year survey[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,151(2):229-234.

[5]Osopale BA,Witthuhn CR,Albertyn J,et al. Culture dependent and independent genomic identification ofAlicyclobacillusspecies in contaminated commercial fruit juices[J]. Food Microbiology,2016,56:21-28.

[6]白淼,张灿,郑文杰,等. 脂环酸芽孢杆菌的分离鉴定与控制技术研究进展[J]. 环境与健康杂志,2015,32(7):650-654.

[7]Lane DJ. 16S/23S rRNA sequencing. In Stackebrandt,E. and Goodfellow,M.(eds),Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics[M]. New York:John Wiley and Sons,1991:115-175.

[8]Marek H,Ma Gorzata D,Katarzyna F. Optimisation of a direct plating method for the detection and enumeration ofAlicyclobacillusacidoterrestrisspores[J]. Journal of Microbiological Methods,2013,92(1):1-8.

[9]Yamazaki K,Tedzuka H,Murakami M. Thermal resistance ofAlicyclobacillusacidoterrestrisspores in different buffers and pH[J]. Food Microbiology,1998,15(6):577-582.

[10]安代志,白淼,张灿,等. 顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用分析果汁中愈创木酚和2,6-二溴苯酚[J]. 分析实验室,2016,35(4):440-442.

[11]Kannenberg E,Blume A,Poralla K. Properties of ω-cyclohexane fatty acids in membranes[J]. FEBS Letters,1984,172(2):331-334.

[12]袁亚宏,刘晓珂,岳田利. 一株源于果园Alicyclobacillus的分离、鉴定及其生物学特性[J]. 食品科学,2012,33(17):129-134.

[13]Goto K,Matsubara H,Mochida K,et al.Alicyclobacillusherbariussp. nov.,a novel bacterium containing omega-cycloheptane fatty acids,isolated from herbal tea[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology,2002,52(1):109-113.

[14]Walls I,Chuyate R.Alicyclobacillus:historical perspective and preliminary characterization study[J]. Dairy,Food & Environmental Sanitation,1998,18:499-503.

[15]Chang S,Kang DH. Development of novelAlicyclobacillusspp. isolation medium[J]. Journal of Applied Microbiology,2005,99(5):1051-1060.

[16]Baumgart J. Media for the detection and enumeration ofAlicyclobacillusacidoterrestrisandAlicyclobacillusacidocaldariusin foods[J]. Progress in Industrial Microbiology,2003,37(3):161-166.

[17]Downes FP,Ito K. Compendium of methods for the microbiological examination of foods[M]. Washington:American Public Health Association,2001:239-244.

[18]Japan Fruit Juice Association. The unified detection method of thermoacidophilic bacteria(TAB)in raw materials of fruit juice[M]. Kajuu Kyoukai Hou:Japan Fruit Juice Association,2003:19-27.

[19]International Federation of Fruit Juice Producers(IFU). Method on the detection of taint producingAlicyclobacillusin fruit juices[M]. Paris:IFU,2007:1-11.

[20]Spllttstoesser DF,Churey JJ,Lee CY. Growth characteristics of aciduric spore forming bacilli isolated from fruit juices[J]. Journal of Food Protection,1994,57(12):1080-1083.

[21]白淼,张灿,安代志,等. 不同种类果汁中脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物污染调查[J]. 食品工业科技,2016,37(24):193-196.

[22]Smit Y,Cameron M,Venter P,et al.Alicyclobacillusspoilage and isolation-a review[J]. Food Microbiology,2011,28(3):331-349.