吴 萍,高 嵩*,徐 建,郑广晶,李亚东,崔宪利
(1.吉林修正药业新药开发有限公司 吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室,长春 130103;2.吉林长白山药业集团股份有限公司,吉林 白山 134300)
精芪双参胶囊由人参、黄芪、丹参、黄精4味中药组成,具有补气养阴、活血化瘀、养心安神等功效。现执行国家药品标准WS-5136(B-0136)-2014Z[1]。标准中收载丹参酮IIA、人参薄层色谱鉴别项及黄芪甲苷含量测定项,人参薄层鉴别方法重现性差,缺少君药丹参含量测定指标。故本文对人参薄层鉴别方法进行了改进,并建立方中君药丹参的高效液相含量测定方法,从而更加全面、准确的控制产品质量[2-3]。
1.1 仪器 Ultimae-3000双三元梯度液相色谱(美国戴安公司)、SLD-1型薄层色谱摄影仪(天津思利达色谱技术开发公司)、AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)、KQ-300DE超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试剂、试药 样品来源:吉林长白山药业集团股份有限公司;对照品来源:人参皂苷Rg1(批号:110703-200424)、人参皂苷Re(批号:110754-201123)、人参皂苷Rb1(批号:110704-201424) 、人参对照药材(批号:120917-201110)、丹酚酸B(批号111562-201514)均购于中国食品药品检定研究院;甲醇、磷酸为色谱纯,水为纯化水,其余试剂均为分析纯。
2.1 供试品溶液的制备 取本品内容物2.5 g,加水30 mL,搅拌均匀,超声处理20 min,离心,取上清液,用三氯甲烷提取2次(轻摇),20 mL/次,弃去三氯甲烷液,水层以水饱和的正丁醇提取2次,30 mL/次,合并正丁醇液,再以正丁醇饱和的氨试液洗2次,60 mL/次,分取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。
2.2 阴性样品溶液制备 按精芪双参胶囊工艺和处方比例,制备缺人参的阴性样品,按2.1项下方法制成阴性样品溶液。
2.3 对照药材溶液制备 取人参对照药材0.5 g,按2.1项下方法制成对照药材溶液。
2.4 对照品溶液制备 取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,分别加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液,作为对照品溶液。
2.5 展开及显色条件
2.5.1 原方法 吸取上述4种溶液各4 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13 : 7 : 2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,置冰箱冷藏层展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,在日光下检视。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,但人参皂苷Rg1与黄芪甲苷色谱斑点分离效果较差[4-7]。
2.5.2 改进的方法 吸取上述4种溶液各2 μL,分别点于同一高效硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(10 : 4 : 5 : 2 : 2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在90 ℃加热至斑点显色清晰,在日光下检视。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,各斑点分离效果较好,方法专属性强,重现性好[8-9]。
2.6 耐用性试验 取1批样品进行耐用性试验。其中包括:1)不同厂家薄层板的考察;2)温度考察;3)湿度考察;4)点样方式考察。具体试验条件见表1。结果:人参薄层鉴别方法耐用性较好。
表1 薄层鉴别耐用性试验条件
3.1 色谱条件 建立色谱柱为Hypecsil ODS C18柱(4. 6 mm ×250 mm,5 μm);以甲醇-0.2%磷酸溶液(40 : 60)为流动相;检测波长为286 nm;理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于4 000。
3.2 对照品溶液制备 取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加70%甲醇制成每1 mL含0.10 mg的溶液,即得。3.3 供试品溶液制备 取装量差异项下本品内容物,混匀,取约0.1 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,加70%甲醇约20 mL,密塞,超声处理(功率400 W,频率为50 kHz)20 min,放冷,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3.4 线性关系的考察 取丹酚酸B对照品溶液(0.10 mg/mL),分别精密吸取2、5、10、15、20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标,以进样量X为横坐标,绘制丹酚酸B标准曲线,结果:回归方程为Y = 1.987 7X-2.448,相关系数r值为1,说明丹酚酸B在0.2~2.0 μg范围内呈良好的线性关系[10-11]。
3.5 专属性试验 按精芪双参胶囊工艺和处方比例,制备缺丹参的阴性样品,同法测定丹酚酸B对照品溶液、供试品溶液及阴性样品的HPLC色谱图。结果:在与对照品色谱相应位置上,供试品溶液与其他组分分离度良好,阴性对照无干扰。
3.6 精密度试验 分别精密吸取同一丹酚酸B对照品溶液10 μL,连续注入液相色谱仪6次, 按上述色谱条件测定峰面积。结果:丹酚酸B相对标准偏差RSD 为0.18% ,表明仪器精密度较好。
3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,按上述色谱条件分别于0、4、8、12、24 h测定1次,记录丹酚酸B峰面积,考察供试品溶液的稳定性。结果:丹酚酸B峰面积相对标准偏差RSD为0.66%,表明供试品溶液中丹酚酸B在24 h内稳定。
3.8 重复性试验 取本品内容物适量,取约0.1 g,精密称定,共6份,按上述色谱条件测定其含量。结果:样品中丹酚酸B平均含量为2.11 mg/粒,相对标准偏差RSD为0.88 %,表明方法重复性较好。
3.9 回收率试验 取已知含量的供试品(丹酚酸B含量2.11 mg/g),取约 0.05 g,6份,精密称定,置于25 mL容量瓶中,精密量取丹酚酸B对照品溶液(0.105 5 mg/mL) 1 mL,6份,分别加入上述容量瓶中,按供试品溶液制备方法操作,制得回收率试验供试品溶液。按正文含量测定项下方法测定,计算回收率。结果:平均回收率为99.60%,RSD为0.56%。表明本方法准确度良好。
3.10 耐用性试验 分别考察流动相流速的变化、流动相比例的变化以及采用不同品牌的色谱柱对同一批样品含量测定结果的影响。结果:在上述条件下测得同一批样品中丹酚酸B含量RSD值<2%。色谱条件在一定范围内变化对试验结果影响较小,表明方法耐用性良好。
3.11 10批样品含量测定 按建立含量测定方法分别测定不同批次精芪双参胶囊中丹酚酸B含量,结果:10批样品每粒含丹参以丹酚酸B计均在1.7 mg以上,根据10批样品的测定结果,按平均含量80%计,制定含量限度范围为本品每粒含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计,不得少于1.5 mg。
由于精芪双参胶囊中人参所含成分复杂且与黄芪所含成分极性相近,薄层鉴别方法所用展开系统也基本相同,普通硅胶G板无法将两者分离。而选择高效硅胶G板时,各成分间分离效果较好。
分别采用1)三氯甲烷-甲醇-水(13 : 7 : 2)10 ℃以下放置的下层溶液;2)三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 : 40 : 22 : 10)10 ℃以下放置的下层溶液;3)三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(5 : 2 : 3 :1 : 1)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,进行试验。结果:以展开剂2)和3)进行试验时,均能将人参皂苷Rg1与干扰成分分离,展开剂3)分离效果最佳。
精芪双参胶囊方中君药丹参的水溶性酚酸类成份具有活血化瘀、通络止痛、养心安神的功效,其代表成分为丹酚酸B,故本文建立丹酚酸B含量测定方法,更全面的监控产品质量。丹酚酸B在检测过程中易发生分解,因此分别重点考察不同柱温及不同浓度磷酸溶液为流动相对丹酚酸B含量的影响,结果柱温在25 ℃以上丹酚酸B的含量随温度升高逐渐降低,且分离效果也逐渐降低;流动相体系中磷酸溶液浓度为0.1%(pH = 2.5)时样品含量及峰对称度均为最佳[12-16]。
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