两种提取骨骼、牙齿DNA的方法

宋 振 ，宋三平，凃 政 ，赵 杰 ，贺永锋,

（1. 陕西省公安厅刑侦局，西安 710018；2. 公安部物证鉴定中心，北京 100038）

骨骼和牙齿的组织结构可有效保护骨细胞与牙釉质，故而能抵抗外界环境因素的影响[1]。因此，对高度腐败及白骨化的尸体进行尸源鉴定，从骨骼和牙齿中提取DNA并进行STR分型检验是可赖以利用的重要技术手段。但传统脱钙法存在提取时间长、有机纯化试剂有毒、得到的DNA浓度低及易于污染等缺点[2-4]，特别是当检材为陈旧骨骼、牙齿时其提取成功率就更低。本文利用Handy-Eco仪器和Freezer Mill冷冻研磨仪结合King fi sher自动化提取系统，提取骨骼和牙齿DNA，研究其对法医学检案的可应用性。

1 材料与方法

1.1 检材来源

本实验室日常检案积累的380例骨骼、牙齿检材，分成常规和疑难两组：常规组包括347例骨骼、牙齿检材（保存年限：2年以内）；疑难组包括33份陈旧骨骼、牙齿检材（其中8份为陈旧骨骼、最长保存年限46年；25份为牙齿、保存年限最长者22年）。

1.2 主要仪器与试剂

9700型PCR扩增仪、3500型遗传分析仪、Identi fi lerPlus试剂盒(Life公司)；骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤公司，King fi sher提取仪专用）；Handy-Eco仪器（韩国世洋公司）；6770-230Freezer-Mill冷冻研磨仪(SPEXSamplePrep公司)；King fi sher自动化提取系统(Thermo公司)。

1.3 检材预处理

1.3.1 常规组骨骼、牙齿预处理（保存2年以内）

取常规骨骼或牙齿检材，用手术刀刮净表面，清洗，晾干，以5 %次氯酸钠溶液处理15 min，蒸馏水清洗3～4次，无水乙醇浸泡一次，除去残余水分，紫外灯下照射20 min。将上述检材用Handy-Eco仪器研磨成粉，取50～150 mg，备用。

1.3.2 疑难组骨骼（牙齿）预处理（保存2年～46年）

骨骼与牙齿的前处理同1.3.1常规组。处理完毕后，陈旧骨骼检材在完整股骨头一端取4～6块(1～2 g/块)骨碎片；陈旧牙齿检材选取整个牙齿。将上述检材用6770-230 Freezer Mill冷冻研磨仪振荡研磨至粉末状，备用。

1.4 检材DNA提取

1.4.1Handy -EcoKing fi sher 法（H-K法）

1）按上述处理的常规组，每份取粉末约50 mg，置于1.5 mL离心管中，加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒的裂解液350μL、蛋白酶K(20 mg/mL)20μL、1mol/L DTT 20μ L(新 鲜 配 制 )；2） 在56℃恒温金属浴（Eppendorf公司）混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜；3）10 000 g离心10 min，取上清液用King fi sher自动化系统提取骨粉DNA，模板DNA最终洗脱体积20μ L。

1.4.2H-K法优化比较

选取常规组中同一个体的骨粉和牙粉、疑难组中22年的骨粉（对照），按上述H-K方法提取DNA，并分别设置不同样本量(50、100、150 mg)及不同消化时间(6、18 h)，以选择确定最佳样本量和消化时间。

1.4.3Freeze -millKing fi sher 法(FM-K法)

1）取8份已处理好的陈旧骨骼粉末各约5 g，已处理好的25颗陈旧牙齿粉末各约1.5 g，于15 mL离心管中加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒裂解液5 mL、蛋白酶 K (20 mg/mL) 200 μ L、1 mol/L DTT 200 μL(新鲜配制)；2）56 ℃恒温金属浴（Eppendorf公司）混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜；3）按前量补加DTT和蛋白酶K；4）再次重复（2）的处理操作；5）10000 g 离心10 min；6）取上清液用King fi sher自动化系统富集所提取的骨粉及牙粉DNA，模板DNA最终洗脱体积15 μL。

1.5 STR分型检测

用Identi fi ler Plus试剂盒进行复合扩增，反应总体积10 μL，其中 DNA 模板4 μ L。反应条件：95 ℃、11 min；94 ℃、20 s；59 ℃、3min；60 ℃、10 min；循环数30。PCR产物在3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，GeneMapper ID-X V1.4软件对电泳数据做分析。

2 结果

2.1 H-K法提取常规组骨骼、牙齿DNA的结果

H-K法提取DNA结果见表1。由表可见，保存时间在2年内、不同保存环境的常规组检材采用H-K法提取成功率达到99.42 %（成功获得15个STR分型结果）。

表1 H-K法提取DNA结果Table 1 DNA Extracted by H-K processing

2.2 H-K法优化后提取DNA的结果

按本文1.4.2项选取检材以及同样的条件与操作进行分组并检验，所得 STR分型结果见表2。可见，随着消化时间的延长和消化骨粉、牙粉量的增加，STR检验的成功率也在增加。因此，对于常规的骨骼、牙齿检材，选用100 mg骨粉或牙粉量、消化时间18 h，就可基本上成功获得STR分型结果。但对于22年的陈旧检材，H-K法检测成功率为0，全部检测失败。

表2 H-K法在不同优化条件下提取DNA结果比较Table 2 Comparison of DNA extracted by H-K processing under different optimal conditions

2.3 FM-K法提取疑难组骨骼牙齿DNA的结果

FM-K法提取DNA结果见表3。疑难组骨骼和牙齿样本采用FM-K法提取成功率达到96.97 %（成功获得12个STR结果以上，具备比对条件）和90.91 %（成功获得15个STR分型结果）。

表3 FM-K法提取DNA结果Table 3 DNA Extracted by FM-K processing

2.4 案例应用

2010年12月，榆林某地发生一起配阴婚盗尸案，嫌疑人盗取埋在地底下46年的一具女性遗骸。遗骸追回后，需做DNA进行亲缘关系比对。采用本文1.4.3FM-K法提取DNA，成功获得了STR分型结果(图1)，为尸源认定提供了重要依据。

1993年5月29日，在蒲城县某一小煤窑井口附近，南某因开煤窑的琐事与王某发生争执而被打伤，后死亡，王某在逃。2015年8月18日，王某归案，需确定22年前受害人南某的身份，开棺提取胫骨一份，采用本文1.4.3FM-K法提取DNA，成功获得了STR分型结果(图2)。

图2 22年陈旧骨骼STR分型结果Fig.2 STR typing from a 22-year bone

3 讨论

目前，骨骼、牙齿DNA检验已成为法医DNA检验鉴定的常规技术[5]，采用脱钙法等传统手段检验，虽然对较为新鲜的骨骼、牙齿成功率能达到97.92%（96例检材中94例成功）[6-7]，但对于陈旧的骨骼、牙齿成功率却相对较低，且存在耗时长、所用有机试剂毒性大、出峰不均衡等缺点[8]。本文利用Handy-Eco仪器和冷冻研磨仪研磨骨骼、牙齿，结合King fi sher自动化提取设备和骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒，使骨骼和牙齿的DNA提取成功率达到99.42 %（常规骨骼牙齿类）和96.97 %（疑难骨骼牙齿类）。

笔者认为，对日常检案中遇到的大部分常规类型骨骼、牙齿检材，由于通常其保存时间不超过2年，保存环境也相对较好，这类检材可用H-K法处理，消化需要的骨粉、牙粉量少，省时省力，STR检出成功率也很高。另外，H-K法所用Handy-Eco仪器与普通电钻相比，还具有以下优点：一是Handy-Eco打磨工具功率相对较低，转速相对较慢，故震动频率就相对较低，摩擦力较小，不易产生过量热能；二是Handy-Eco打磨工具易控制转速，操作简单，稳定性好，便于单手掌握；三是Handy-Eco打磨工具的转头小巧轻便，易更换，一物证一转头，能防污染，经济成本低；四是经过Handy-Eco打磨工具处理过的骨粉或者牙粉比较细腻，有利于下一步的消化。

本文所有检材均来自于日常检案，故所讨论的H-K法也是因工作实际需要而建立，后来逐步优化。对于常规骨骼检材，取材量50 mg和消化6 h的条件并不能获得理想的STR分型结果，但适当增加取材量（100 mg）及延长消化时间（18 h，低转数震荡过夜）后，便可有效提高提取成功率。当然，取材时需选用完整性相对较好的骨松质和骨密质。对于牙齿检材，磨牙粉时需磨到牙髓处。另外，在DNA扩增阶段适当增加PCR循环数，也可提高扩增成功率[2]。

对于疑难骨骼、牙齿检材，比如时间过久，保存环境恶劣，检材量非常少的情况，使用H-K法的成功率基本上为零（见表2），此时可考虑直接选用FM-K法，因为：1）在超低温环境下打磨骨骼、牙齿，有利于最大程度地保护其中的DNA；2）消化时骨粉用量比较大，其中的骨细胞含量相对增加，在一定程度上提高了检测成功率；3）FM-K法与传统脱钙法相比，提取时间短，操作步骤少，实验周期紧凑，自动化程度高，污染风险也低[9]；4）King fi sher自动化提取系统能将大量的裂解液进行富集，且最小洗脱体积仍可达到15 μ L，获得的DNA浓度和纯度均较高。

综上所述，本文提取骨骼牙齿DNA的方法，操作步骤简单，使用常规试剂，成本低，成功率高，适于基层法医对陈旧骨骼、牙齿中的DNA进行检验。

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