外源病毒检验用抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清的制备与检定

毛娅卿，吴 涛，王 嘉，王 哲，孔冬妮，李 岭，李慧姣，蒋桃珍，李俊平

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是一种由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的常见急性、高度传染性，并具有重大经济意义的病毒病。目前国内外主要靠疫苗接种来防治该病[1-2]。根据现行《中华人民共和国兽药典》（简称《中国兽药典》）三部的规定[3]，IBV活疫苗成品或制作疫苗的毒种须用抗 IBV 特异性血清进行中和试验，以检验外源病毒。鉴于当前兽用生物制品生产企业检验所使用抗IBV特异性血清难以满足实际需求，本研究优化了免疫条件，利用 IBV活疫苗进行基础免疫，再用灭活苗进行加强免疫，制备了抗 IBV特异性血清，并对其纯净性、中和效价及特异性进行了鉴定。

1 材料

1.1 毒种

IBV H120 株、M41株，鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）B87株，鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）La Sota株，鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis disease virus，ILTV），鸡痘病毒（Avian pox virus，APV），禽呼肠孤病毒（Avian reo virus，ReoV）S1133株：由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

1.2 试验动物

SPF鸡胚和鸡：由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

1.3 试剂和试剂盒

NDV红细胞凝集抑制试验抗原、鸡马立克氏病病毒（Marek's disease virus，MDV）琼脂凝胶扩散试验抗原、减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）红细胞凝集抑制试验抗原、APV琼脂凝胶扩散试验抗原：中国兽医药品监察所制备、提供；禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5、H9 亚型红细胞凝集抑制试验抗原：购自哈尔滨维科生物技术开发公司；ILTV 抗 体 检测 试 剂 盒：购 自 Biocheck 公 司；鸡传染性贫血病 毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV），IBV，ReoV，禽网状内皮组织增生症病毒（Avian reticuloendotheliosis virus，REV），禽脑脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV），禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV，A、B亚群）等抗体检测试剂盒：购自 IDEXX 公司。

2 方法

2.1 抗原制备

IBV H120株、M41株繁殖及灭活抗原乳剂的制备，均参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版简称《中国兽用生物制品规程》）[4]。

2.2 免疫程序

取SPF鸡300只（3～4周龄），以IBV H120株活疫苗进行基础免疫，再用IBV M41株油乳剂灭活疫苗加强免疫2～3次。

2.3 血清采集与分离

最后一次免疫21 d后，将所有鸡进行心脏采血并分离血清。

2.4 半成品检验与分装

将收集的血清，按现行《中国兽药典》进行无菌检验。将血清混合后分装入瓶（2 mL/瓶），参照《中国兽用生物制品规程》（2000年版）要求进行冷冻、真空干燥。

2.5 无菌检验与中和效价测定

外源病毒检验和剩余水分测定按现行《中国兽药典》三部进行。将抗IBV特异性血清用灭菌生理盐水恢复至2 mL后，进行200、400、800、1 600倍稀释，分别与等体积的IBV H120株病毒液（100 EID50/0.1 mL）混合，室温（18～25 ℃）作用1 h；经尿囊腔接种 SPF鸡胚（10～11日龄），每个稀释度接种鸡胚5枚（0.2 mL/胚）；设病毒对照，鸡胚5枚，病毒液接种0.1 mL/胚；置37 ℃孵育6 d；每日照蛋，记录鸡胚死亡情况，按Reed-Muench法计算中和效价。

2.6 特异性检验

2.6.1 交叉中和试验 将NDV LaSota 株、IBV H120株、ILTV、APV、IBDV B87株、ReoV S1133等毒种做10倍系列稀释，分装于2列试管中。一组取适宜稀释度加入等量的抗IBV特异性血清；另一组加入等量的阴性血清，室温作用1 h后，经尿囊腔（绒毛尿囊膜）接种SPF 鸡胚（9～11日龄），置37 ℃孵育，计算中和指数。

2.6.2 抗体检测 将抗IBV特异性血清，按照表1中列出的检验方法，对 IBDV、APV、ILTV、NDV、Reo V、REV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV（H5、H9亚型）和ALV（A、B 亚群）进行抗体检测。

表1 病原抗体及其检验方法

2.7 中和试验和外源病毒检验

按照现行《中国兽药典》三部要求，将本研究制备的抗IBV特异性血清，分别与IBV种毒、活疫苗进行中和试验和外源病毒检验。

2.7.1 IBV H120株种毒中和试验 将制备的抗IBV特异性血清，用灭菌生理盐水分别进行10、20、40倍稀释，然后与等量（104.5EID50/0.1 mL 10羽份）的IBV H120株病毒液混合，室温作用1 h；经尿囊腔接种SPF鸡胚（10～11日龄），接种5枚（0.2 mL/胚），同时设病毒对照；37 ℃培养6 d，每日照蛋，记录鸡胚死亡情况。

2.7.2 IBV活疫苗（H120株）外源病毒检验 按照现行《中国兽药典》三部要求，将3批疫苗样品分别稀释至10羽份/0.1 mL，然后与等体积的抗IBV特异性血清混合，37 ℃中和1 h；接种SPF鸡胚（10日龄），进行外源病毒检验。

3 结果与分析

3.1 无菌检验与外源病毒检验

随机选取5瓶冻干的抗 IBV 特异性血清进行无菌检验，未发现菌生长。随机选取3瓶冻干的抗IBV特异性血清中进行外源病毒检验，未发现外源病毒污染。

3.2 剩余水分与中和效价测定

随机选取4瓶冻干的抗IBV特异性血清中进行剩余水分测定，发现含量分别为2.0%、2.3%、2.2%、2.1%。用IBV H120株进行基础免疫，再用IBV M41株油乳剂灭活疫苗加强免疫，制备抗 IBV特异性血清8 000 mL，发现中和效价为1∶800（表2）。

表2 抗IBV 特异性血清中和效价测定

3.3 特异性

3.3.1 交叉中和试验 将抗IBV特异性血清与IBV H120株进行中和试验，发现中和指数为106.3， 与 IBDV B87株、ILTV、NDV La Sota株、ReoV S1133株、APV的中和指数均不大于 10（表3）。

表3 抗 NDV 特异性血清交叉中和

3.3.2 抗体检测 经 AGP、ELISA、HI方法检测，本研究制备的抗IBV 特异性血清不含APV、IBDV、NDV、ILTV、REV、ReoV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV（H5、H9亚 型） 和ALV（A、B亚群）抗体，表明本血清具有良好的特异性。

3.4 中和试验与和外源病毒检验

3.4.1 IBV H120株种毒中和试验 试验制备的抗IBV特异性血清20倍稀释后可完全中和104.5EID50病毒。

3.4.2 IBV活疫苗（H120株）外源病毒检验 结果均为阴性，表明2 mL抗IBV特异性血清能够完全中和每批次各10羽份的疫苗样品。

4 讨论

IBV为非细胞适应性病毒，因此在外源病毒检验的鸡胚检查法中，只需将IBV活疫苗或毒种稀释成10羽份/0.1 mL（含104.5EID50），然后与等量抗血清中和即可。这就要求抗血清应具有良好的特异性和较高的效价。本实验室借助多年积累的经验[5～9]，通过优化免疫方法，制备了 8 000 mL抗血清。对该血清进行无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定，发现结果均符合现行《中国兽药典》三部规定。为保证抗血清的单特异性，疫苗选用的是中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存的 IBV H120、M41株毒种制备的试验用疫苗，并按照《中国兽用生物制品规程》（2000年）进行鉴定。

本研究在首免前，对试验用SPF鸡进行了血清抗体筛查，确保了无外源病毒感染。试验用SPF鸡专门饲养在隔离器中，接受严格管控，以降低微生物感染风险；建立了完善的卫生防疫和消毒机制，以确保整个实验过程无外界病原微生物污染；使用活疫苗进行基础免疫，再用灭活疫苗加强免疫，提高了抗血清的中和效价。

本研究采用2种试验方法，对IBV抗血清进行了特异性检验，涵盖了13种禽源病毒抗体，确保了试验结果的准确性。

5 结论

本研究通过优化免疫制备的8 000 mL抗IBV特异性抗血清，经鉴定证实纯净，无细菌、支原体或其他外源病毒污染，剩余水分测定结果符合《中国兽药典》三部规定。

制备的IBV抗血清特异性检验结果表明：本抗血清与IBV H120株的中和指数为106.3，与IBDV B87株、NDV La Sota株、ILTV、APV和 ReoV S1133 株的中和指数均不大于10；经HI、AGP、ELISA 方法检测，IBDV抗体等13种禽源病毒抗体均为阴性；血清中和效价为1∶800，20倍稀释后能等量中和10羽份/0.1 mL（含104.5EID50）的IBV疫苗或种毒。

检测结果表明，本研究制备的IBV抗血清具有良好的特异性，可以用于IBV活疫苗或种毒的外源病毒检验。

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[4] 农业部兽用生物制品规程委员会. 中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年）[M].北京：科学出版社，2000.

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