酸性蛋白酶在小麦淀粉乳酒母培养中的应用

方颂平，梁臣臣，田启梅，程抱奎，戚春江，周鹏磊，郭文杰

（安徽瑞福祥食品有限公司，安徽亳州 236800）

酒母培养是酒精发酵的重要环节，酒精发酵过程中酒母培养的好坏，直接影响酒精出酒率。以玉米、木薯、糖蜜等为原料生产酒精[1]，酒母培养通常要求外观糖度在10°Bx左右，培养过程中需添加尿素、磷酸二氢钾等无机盐，促进酒母生长繁殖。以小麦粉提取谷朊粉后的淀粉乳生产酒精[2]，淀粉乳中含有大量水溶性蛋白，在酒母培养过程中添加酸性蛋白酶，将部分水溶性蛋白分解为酵母可利用的短肽、氨基酸等有机氮源[3-4]，为酵母细胞的生长提供丰富的营养物质，可少用或不用营养盐，减轻酒精废水COD和磷的处理负荷[5]；此外，传统原料酒母培养要求外观糖度在10°Bx左右，本试验通过不稀释糖化醪进行酒母培养，提高了发酵醪的酒精度，降低了酒精生产的能耗成本。

本试验以小麦淀粉乳为原料，研究小麦酒精生产过程中不稀释酒母培养工艺，通过调节pH值和添加酸性蛋白酶的方式，达到酒精生产所要求的酒母培养质量要求，为小麦酒精工艺优化和节能降耗提供一些思路。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦淀粉乳，安徽瑞福祥食品有限公司；淀粉酶100000 U/g，杰能科（中国）生物工程有限公司；糖化酶200000 U/g，杰能科（中国）生物工程有限公司；酸性蛋白酶100000 U/g，杰能科（中国）生物工程有限公司；耐高温酿酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；硫酸，国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：显微镜（BX41 OLYMPUS）；恒温摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；40 m3酒母培养罐。

1.2 检验方法

镜检：采用血球计数板和次甲基蓝染色法，测定酒母醪中的酒母细胞数、出芽率和死亡率。

1.3 试验方法

1.3.1 糖化醪的制备

取谷朊粉车间A/B混合淀粉乳，固形物浓度在20%左右，加一定量的耐高温α-淀粉酶，水浴锅煮沸，液化60 min，降温至60℃，添加糖化酶，60℃糖化40 min，降温至30℃，即可。

1.3.2 试验室培养酒母

取100 mL糖化醪置于500 mL三角瓶内，加入干酵母，按不同试验条件，在恒温摇床进行酒母培养，培养时间6 h，培养温度30℃，摇床转速100 r/min。

1.3.3 车间40 m3酒母罐循环培养酒母

酒母罐灭菌后，注入车间制备的糖化醪，加入复活后的酵母，按不同试验条件，通入空气，开启搅拌，温度控制在30℃，第一罐培养10 h，此后每罐培养8 h，计数酵母，每次培养结束后放出2/3酒母醪，重新补足糖化醪和酸性蛋白酶。

2 结果与分析

2.1 不同营养盐对酒母培养的影响

本试验中，对照组使用稀释后的糖化醪，营养盐为尿素和磷酸二氢钾，添加量为0.025 g和0.0125 g；试验组采用不稀释糖化醪，酸性蛋白酶添加量为0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L，培养结果见表1。

表1 不同营养盐培养结果

酒精发酵的主体是酵母菌，强壮的酵母细胞可耐受更高浓度醪液和酒精，试验中通过检测酵母生长状况，发现添加酸性蛋白酶，对酵母细胞的生长繁殖有明显的促进作用。

由表1可以看出，在不稀释的糖化醪中加入酸性蛋白酶可显著提高酒母细胞数和出芽率，同时死亡率显著下降。当酸性蛋白酶添加量为5 mg/L时，酵母细胞数已超过无机盐的1.5倍，这表明酸性蛋白酶加入到小麦淀粉糖化醪中起到了预期的效果，酸性蛋白酶可替代无机营养盐进行不稀释酒母培养。由于小麦淀粉中营养物质贫乏，仅依靠添加无机盐并不能完全提供酒母生长所需要的营养，而小麦淀粉乳中含有大量的水溶性蛋白，这部分蛋白不能直接为酵母细胞利用，通过加入酸性蛋白酶，将水溶性蛋白分解为酵母细胞可利用的游离氨基酸，为其生长提供丰富的有机氮源，可促进其代谢与繁殖。

图1 不同酸性蛋白酶添加量对酵母细胞数和出芽率的影响

由图1可知，随着酸性蛋白酶用量的增加，酒母细胞数和出芽率均增长，但在添加量达到10 mg/L后，两者都未再出现明显的增加。因此，从经济角度考虑，酸性蛋白酶的适宜添加量为10 mg/L。

2.2 不同pH值对不稀释醪酒母培养的影响

由于酵母细胞对pH值要求较为严格，pH值过高或过低都会影响酵母细胞的生长。此外，醪液中的pH值会影响酸性蛋白酶的使用效果，进而影响酵母细胞的生长繁殖。小麦淀粉乳由于加工工艺较长，淀粉乳pH值在5.0左右，因此有必要研究不同pH值下，酸性蛋白酶对酵母生长的影响。

本试验中，酸性蛋白酶添加为10 mg/L，调节糖化醪初始pH值分别为3、4、5、6、7，培养结果见表2和图2。

表2 pH值对酸性蛋白酶培养酒母的影响

图2 不同初始pH值对酵母细胞数和出芽率的影响

pH值对不稀释酵母培养的影响结果见图2。由图2可看出，在一定pH值范围内，随着pH值的升高，酵母细胞数和出芽率逐渐增加，在pH6.0时，分别达到最大值1.38×108个/mL和15.2%，而后下降。由此可以得出，不稀释酒母培养的最佳pH值为6.0。pH值过低或过高，影响糖化醪中液化酶和糖化酶的使用效果，酵母营养不良，影响培养质量。

2.3 酸性蛋白酶对不稀释醪酒母培养大生产试验

为检验酸性蛋白酶的实际应用效果，以试验确定的酸性蛋白酶使用量和pH值，进行生产性酒母罐培养酒母试验。

在本试验中，试验组采用不稀释糖化醪，调节pH值6.0，添加酸性蛋白酶10 mg/L；对照组采用稀释糖化醪，不调pH值，营养盐为尿素和磷酸二氢钾，培养结果见表3。

表3 车间大酒母罐培养结果

从表3可以看出，试验组添加酸性蛋白酶进行酒母培养时，细胞数、出芽率和死亡率均明显优于对照组，酵母细胞数平均可达到对照组的2倍。此外，试验组传代11次时，细胞数依然达2.3×108个/mL，而传统稀醪无机盐仅培养7代，细胞数就近乎为零。表明在不稀释醪中加入酸性蛋白酶培养酒母具有更好的效果。

3 结论

3.1 以小麦粉提取谷朊粉后的淀粉乳生产酒精酒母培养中，添加无机营养盐不能完全满足酵母的生长需要，而酸性蛋白酶可使小麦淀粉乳中水溶性蛋白分解为酵母细胞可直接利用的短肽和α-氨基氮，可为酵母提供丰富的有机营养源，并显著促进酵母生长与繁殖。

3.2 试验结果表明，使用酸性蛋白酶对不稀释糖化醪进行酒母培养，培养的最佳pH值为6.0，酸性蛋白酶适宜用量为10 mg/L。通过试验表明，可显著提高细胞数和出芽率，并且延长酒母传代次数，这不仅可节约干酵母的使用量，对企业生产上节能降耗等方面也有一定的指导意义。

[1]谢伯达.探索燃料酒精的开发应用[J].福建能源开发与节约,2001(4)：33-34.

[2]赵银峰.小麦酒精发酵新工艺的研究[D].郑州：郑州大学,2005：6-9.

[3]唐胜球,童小英,许梓荣.酒用酸性蛋白酶的研究进展[J].酿酒科技,2005(1)：41-44.

[4]阎致远,张益庆,廖德胜.酸性蛋白酶生产酒的代谢研究[J].粮食与饲料工业,1995(8)：24-25.

[5]李传林.应用浓醪发酵技术,推动酒精工业节能及清洁生产[J].酿酒科技,2005(5)：107.