天麻多糖的提取及其饮料的研制

郑捷，孙朋朋，胡爱军，2，*，胡小华，任圆圆，于思雨

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457；2.天津市宽达水产食品有限公司，天津300304）

天麻又名赤箭、定风草、独摇芝，为兰科天麻属植物。据神农本草经和本草纲目记载，天麻（Gastrodia elata Bl.）有非常好的药理作用，是一种传统名贵中药。天麻对小儿惊厥[1]、记忆力减退[2]、坐骨神经病[3]、头晕目眩、癫痫[4-5]等疾病有治疗作用。它在锡兰、新几内亚、澳大利亚、中国、朝鲜、日本和印度的多山地区均有种植[6]。在中国，野生天麻主要分布在四川、广东、云南等省[7]。天麻含有多糖、有机酸、类固醇、酚类化合物等功能成分[8-10]。其特有的天麻素更是有着镇静安眠[11]、抗偏头痛[12]、抗肝硬化[13]等功效。

天麻中含有丰富的天麻多糖，具有很好的药理作用。缪化春等[1]发现天麻多糖能够明显降低高血压模型大鼠的收缩压和舒张压。Hong Qiu等[14]从天麻中分离出 α-D-（1-4）葡聚糖和 α-（1-4）葡聚糖（WGEW、AGEW），发现这两种葡聚糖衍生物对登革热病毒有抑制作用。Xia Chen等[15]从天麻块茎中分离出一种水溶性的葡聚糖（WTMA），它能够抑制胰腺癌细胞的繁殖。天麻多糖还有清除自由基、抗衰老的作用[16]。目前对天麻及其多糖的研究主要集中在药理方面，而其食药兼用、保健功能方面的研究仍具有重大潜在价值，值得进一步开发。现在市场上的天麻产品主要是含有天麻素的一些制剂，天麻多糖类产品未见报道。本试验采用单因素正交试验优化了天麻多糖的最佳提取条件，并采用天麻多糖提取液、红枣汁、柠檬酸、白砂糖复配出一款抗氧化活性较好的天麻多糖饮料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天麻：陕西略阳县中药材技术推广服务中心提供；红枣、白砂糖：超市购买；柠檬酸：天津奥凯化工贸易有限公司；葡萄糖、重蒸酚、铁氰化钾、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TDZ5-W型离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；D66-101-1电子天平：天津市天宇试验仪器有限公司；LGJ0.5型冻干机：北京四环科学仪器厂；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；752型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；HW·SY21-K电热恒温水浴锅：北京市长风仪器仪表公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

取天麻药材，切片，干燥（80℃，1 h），粉碎，粉末过60目筛，备用。

1.3.2 天麻多糖提取方法

称取适量的天麻粉末，加入一定比例的蒸馏水，在恒温状态下持续搅拌，一段时间后，离心（4 000 r/min，20 min），取上清液，得到天麻多糖提取液。

1.3.3 天麻多糖含量的测定方法

采取苯酚-硫酸法[17-18]测定天麻多糖的含量。以葡萄糖的质量浓度（C，mg/mL）为横坐标，以吸光值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。经回归处理得线性回归方程：Y=16.473X+0.004 7，R2=0.999 4。葡萄糖标准曲线见图1。

1.3.4 天麻多糖得率的测定

准确称取20 mg多糖粗品溶于水，定容于100 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法测定吸光度，代入标准曲线得样品中的糖含量。天麻多糖得率计算公式如下：

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

式中：W为多糖得率，%；C为从曲线中查出的糖浓度，mg/mL；M1为多糖质量；M2为原料质量。

1.4 天麻多糖提取单因素试验

1.4.1 料液比对天麻多糖得率的影响

称取原料 5.00 g，料液比分别为 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g），60 ℃提取 1 h，苯酚－硫酸法测糖含量。

1.4.2 温度对天麻多糖得率的影响

称取原料 5.00 g，料液比 30 ∶1（mL/g），分别在 30、40、50、60、70 ℃，提取 1 h，苯酚－硫酸法测糖含量。

1.4.3 提取时间对天麻多糖得率的影响

称取原料 5.00 g，料液比 30∶1（mL/g），分别在 60 ℃提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，苯酚－硫酸法测糖含量。

1.5 L9（33）正交试验

称取天麻粉末5.00 g，在单因素的基础上，以温度、液料比和提取时间进行正交试验，正交试验设计方案见表1。

表1 正交试验L9（33）的因素与水平Table 1Factors and levels of L9（33）orthogonal text

1.6 天麻多糖饮料的制备

1.6.1 原料处理

1）根据天麻多糖提取最优工艺条件，称取天麻粉末，加入35倍量净化水，在60℃提取2 h，提取液离心过滤备用。2）选择核小肉厚、物霉烂、无虫蛀的红枣，去核，用6倍量的净化水在85℃提取2次，每次提取2 h，合并提取液，过滤备用。

1.6.2 天麻提取液及枣汁不同配比预选

随机挑选20个经培训的食品相关专业的学生和老师，以口感和风味为主要指标，按照表2对天麻提取液及枣汁不同配比进行感官评价，选择口感、风味较好的配比。

表2 天麻提取液和大枣提取液不同配比Table 2 Different extract ration of gastrodia elata and jujube

1.6.3 糖酸比单因素试验

白砂糖和柠檬酸的比例分别为100∶1、120∶1、140∶1、160 ∶1、180 ∶1（体积比），以甜度程度为感官评价指标，选取最优的天麻提取液及大枣提取液配比。

1.6.4 天麻饮品配方优化

对不同配比的天麻提取液与枣汁、白砂糖、柠檬酸进行L9（34）正交试验，通过模糊评定法给出各配方的综合评分，评分标准：评定论域{气味，香气，酸度，甜度，苦涩}，权重系数 {0.15，0.20，0.20，0.25，0.2}，评语论域 {<60，60~70，70~80，80~90，90~100}。正交设计表见表3。

表3 饮料配方优化正交试验表Table 3 Levels and factors of orthogonal test

1.7 天麻饮料抗氧化活性的测定

1.7.1 还原能力的测定

参考周海华等的方法[19]，取天麻饮品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加入试管中，不足1.0 mL用蒸馏水补足至1.0 mL，各管再加入0.2 mol/L，pH6.6的磷酸缓冲液2.5 mL 和质量分数 1%铁氰化钾（K3Fe（CN）6）溶液2.5 mL，混合后在50℃保温20 min后冷却，加入质量分数10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混合后以3000r/min的速度离心10 min，取上层液体2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和质量分数0.1%氯化铁2.5 mL，混匀，静置10 min，在700 nm处测定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，还原力越强。以蒸馏水代替三氯化铁溶液作为空白调零。

1.7.2 羟基自由基清除能力的测定

参考王宗君等的方法[20]，在各试管中分别加入不同浓度的天麻饮品1.0 mL、8.8 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL，9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液各1.0 mL，最后加入H2O2启动反应，37℃反应0.5 h，在510 nm下测量各溶液的吸光度。考虑到天麻饮品本身的吸光度，以8.8 mmo1/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL、不同浓度的天麻饮品1.0 mL和蒸馏水1.0 mL为天麻饮品的本底吸收。清除率计算公式：

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ai为加入天麻饮品后的吸光度；Aj为不加H2O2天麻饮品本底的吸光度。

1.8 数据分析

采用SPSS 20.0对数据进行显著性分析，结果以平均值±标准偏差表示。P＜0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著差异，所有试验均重复3次。所有图中出现的字母代表不同水平之间的显著性，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，大写字母表示置信度0.01水平所测得，小写字母表示置信度0.05水平下所测得。

2 结果与分析

2.1 液料比对天麻多糖得率的影响

在提取温度为60℃，提取时间为1 h条件下，不同液料比 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g）对多糖得率的影响如图2所示。

图2 料液比对天麻多糖得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide yield

由图 2 可知，液料比在 15∶1（mL/g）～25∶1（mL/g）范围内，天麻多糖得率从8.92%快速增加到11.93%，液料比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）范围内时，增加的趋势明显变缓，天麻多糖得率在液料比30∶1（mL/g）时（11.93%）与 35∶1（mL/g）（11.96%）相比，差异不显著，这可能是因为随着料液浓度升高，天麻组织内外浓度差也相应升高，天麻多糖不易溶出的原因[21]，也可能是因为液料比在25∶1（mL/g）时，天麻多糖的溶出量大于其它杂质的溶出量，随着料液浓度的升高，其它杂质溶出量大于天麻多糖[22]。

2.2 提取温度对天麻多糖得率的影响

在天麻液料比 30∶1（mL/g），提取时间 60 min的条件下，研究不同提取温度 30、40、50、60、70 ℃对天麻多糖得率的影响，如图3所示。

图3 提取温度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of different temperature on polysaccharide yield

由图3可知，30℃～50℃，随着温度的升高，天麻多糖得率增加显著，温度达到60℃时，天麻多糖得率达到最大值（12.21%），60℃～70℃，天麻多糖得率下降，这可能是因为适当的温度有利于暴露羟基的大分子物质空间构象的解析叠，进而促进氢键的形成或连接，多糖的亲水性增加[23]；但是过高的温度会引起多糖的降解反应[24]。

2.3 提取时间天麻多糖得率的影响

天麻液料比 30∶1（mL/g），提取温度 60℃，研究提取不同时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对天麻多糖得率的影响，如图4所示。

由图4可知，随着提取时间的延长，天麻多糖得率在不断增加，在0.5 h～1.5 h之间，随着时间的延长，天麻得率显著增加，当时间达到1.5 h后，天麻多糖得率趋于稳定，这是可能因为在1.5 h时，提取液与细胞内多糖浓度基本平衡，超过1.5 h，原料中有杂质溶出，部分多糖发生降解[25]。

2.4 天麻多糖提取正交试验结果

在单因素基础上做正交试验，结果如表4所示，正交试验方差分析结果见表5。

图4 提取时间天麻多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal array design test

表5 正交试验方差分析结果Table 5 Results of analysis of variance

分析可知，各因素对多糖得率的影响顺序为：A＞C＞B；即提取温度＞提取时间＞料液比。根据方差分析结果，提取温度为显著性影响因素。正交试验得到的最佳提取条件为：A3B3C1即提取温度50℃，液料比35 ∶1（mL/g），提取时间 2 h。验证试验：天麻多糖得率为13.46%。

2.5 天麻饮料的制备

2.5.1 天麻提取液与枣汁不同配比的单因素试验

以天麻提取液为主体部分，口感和风味为主要指标，对天麻提取液及枣汁不同配比进行感官评价，评价结果见表6。

表6 天麻提取液和红枣提取液不同配比的评价结果Table 6 The evaluation results of different extract ration of gastrodia elata and red dates

由表6可知，当天麻提取液70%，大枣提取液30%时，苦涩味较淡，同时能保留天麻和大枣的风味，初步选定天麻提取液和大枣提取液的配比为7∶3（体积比）。

2.5.2 不同糖酸比的单因素试验

确定天麻提取液和大枣提取液的配比后，添加不同的糖酸比，进行感官评价，结果见表7。

表7 糖酸比预选Table 7 Selection of sugar-acid proportions

2.5.3 天麻饮料配方优化

选取白砂糖、柠檬酸、天麻提取液和大枣提取液的配比做L9（34）正交试验，并运用模糊综合评价法进行品质测评。测评结果见表8，方差分析结果见表9。

表8 感官评价结果Tablet 8 The sensory evaluation result

续表8 感官评价结果Continue tablet 8 The sensory evaluation result

表9 正交试验方差分析表Table 9 Variance analysis of orthogonal tests

由表8和表9可知，影响天麻饮料配方的各因素的主次顺序为：B＞A＞C，即白砂糖＞天麻多糖与红枣提取液＞柠檬酸，而且白砂糖、天麻多糖和大枣提取液的用量对感官评分的影响都达到了极显著水平，分析得出最佳水平组合为A2B1C2，即天麻提取物：枣汁为7∶3（体积比）、白砂糖6%、柠檬酸0.05%，此结果与感官评分得分最高的组合A2B1C2相符。

2.5.4 天麻饮料抗氧化能力的测定

在一般情况下，样品的还原力与抗氧化活性之间有显著的相关性，吸光度越大表示还原力越强见图5。

图5 天麻饮料的还原能力Fig.5 Reduction capacity of gastrodia elata drinks

由图5可知，天麻饮品具有一定的还原能力，还原力随着天麻饮品量的增大而增加。

2.5.5 天麻饮料羟基自由基清除能力测定

羟自由基的化学性质非常活泼，其毒性也是最大的，可与多种有机物或无机物反应。对天麻饮料进行不同程度的浓缩或稀释，测定其清除羟基自由基的能力，结果见图6。

图6 天麻饮料对·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of gastrodia elata drinks on·OH

由图6可知，天麻饮料对·OH有很好的清除能力，并在一定的范围内显现出剂量效应，天麻饮料原液对羟基自由基的清除率达到了80.65%，浓缩为原液的2倍后天麻饮品的抗氧化性达到96.30%，继续浓缩，天麻饮品浓度继续升高，清除能力趋于平衡，不再升高。

2.6 天麻饮品的质量评价

2.6.1 感观指标

色泽：浅红色；

滋味及气味：天麻、红枣味协调一致，酸甜适中，无异味；

组织形态：汁液均匀一致，无杂质。

2.6.2 理化指标

可溶性固形物（糖度）为9°Bx左右，酸度为pH值4.6左右。

2.6.3 卫生指标

细菌总数≤100个/mL，大肠菌群数≤6个/mL，致病菌未检出。

3 结论

天麻多糖的最佳提取条件为：提取温度80℃，液料比30∶1（mL/g），提取时间 2 h，此时天麻多糖得率为13.46%。此外，通过单因素和正交试验确定了天麻饮料的最佳配方为天麻提取液∶红枣汁7∶3体积比、白砂糖6%、柠檬酸0.05%，该饮料具有较好的抗氧化活性。

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