西瓜花叶病毒辽宁臭椿分离物的鉴定与全序列分析

付晶晶，杨彩霞，韩 彤，廖一鸣，王 昕，付春亭，冯 雨，武井昕

(沈阳大学 生命科学与工程学院/辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 110044)

西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的成员。病毒粒子为弯曲线状，无包膜，直径 11～13 nm，典型长度为680～900 nm[1]。基因组是长约9.7 kb的单分子线形正义ssRNA，编码一个长的多聚蛋白，随后切割产生8～10个产物参与病毒的复制、运动和包装。在自然界中，主要以蚜虫(如桃蚜和棉蚜)以非持久性方式进行传播[2]，也能通过汁液摩擦传染。WMV寄主范围广泛，除主要侵染葫芦科(西瓜、瓠瓜、西葫芦、南瓜、黄瓜、甜瓜、罗汉果、冬瓜和哈密瓜)植物[1,3-7]之外，还可侵染茄科(甜椒)、五加科(人参)、锦葵科(野葵)、豆科(刺槐)、兰科(石斛兰)、西番莲科(百香果)和芸香科(柠檬)等多种植物[8-11]，造成植物叶片花叶和皱缩、生长受阻、坐瓜难、畸形果等问题，使产量和商品性降低，直接影响种植者的收益。在中国，WMV已在山东、山西、新疆、上海、北京、海南、新疆和陕西等地的葫芦科植物(西瓜和南瓜)、胡麻科(芝麻)和苦木科(臭椿)上[12-21]被发现。2015年，在辽宁盖州地区采集到花叶症状的臭椿，通过透射电镜观察和RT-PCR扩增病毒的全基因组序列，明确了侵染臭椿的病毒为WMV。

1 材料与方法

1.1 试验材料

图1 表现花叶症状的臭椿Fig.1 The Ailanthus altissima plants showing yellow mosaic symptoms

2015年10月，于辽宁省盖州市采集表现花叶症状的臭椿(Ailanthusaltissima)，移回本实验室栽培(图1)。

1.2 试验方法

1.2.1 透射电镜观察法 在高压灭菌的研钵中加少量PB溶液，将新鲜病叶放置其中研磨至匀浆状，6 000 r/min，离心3 min。吸取上清液，将铜网放入其中漂染3 min后，置2%磷钨酸中染色10 s，于透射电镜下(Hitachi TEM system)观察。

1.2.2 RT-PCR检测病毒基因组 采用TRIzol法对臭椿病叶的总RNA进行提取，实验步骤按照说明书进行。称取1 g植物样品于研钵中，加入液氮研成粉末，移入1.5 mL Eppendorf管，立即加入1 mL TRIzol，室温放置10 min以裂解细胞；4 ℃，12 000 r/min离心15 min；取上清液，加入等体积氯仿并剧烈震荡，室温放置3 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min；取上清并加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀4 ℃过夜；4 ℃，12 000 r/min离心15 min；弃上清，用1 mL 75%无水乙醇洗涤沉淀；4 ℃，12 000 r/min 离心15 min；弃上清，室温干燥，加入RNase-free H2O溶解。随后，以Oligo(dT)作为引物，使用TIANScript RT Kit反转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对已提取的RNA进行cDNA第一条链的合成。

以该cDNA为模板，进行PCR扩增。PVY通用引物PVY-Legpoty-F/PVY-Legpoty-R(5′-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3′/5′-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3′)。PCR反应体系为25 μL，循环参数为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，实验进行35个循环；72 ℃延伸10 min。病毒全基因组序列由三对引物扩增，WMV-5NF/WMV-5NR(5′-AAATTAAAACWACTCATAAAGA-3′/5′-CCTTGTAGTACGCTGGTCATCTG-3′)、WMV-MNF/WMV-MNR5′-CTCCACATACGGAGAAATG-3′/5′-CCAACCATACAAACTCGCTC-3′)和WMV-3NF/WMV-3NR5′-ATGTWGGAGTTGGGTATGG-3′/5′-AGGTACGGTAATGTTTGTTGTTCC-3′)扩增得到，PCR反应体系为25 μL，循环参数为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，实验进行35个循环；72 ℃延伸10 min。引物由沈阳力新生物技术有限公司合成。

PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，利用TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技(北京)有限公司)凝胶回收试剂盒对目的DNA条带进行回收和纯化。回收产物与pMD18-T(宝生物工程(大连)有限公司)克隆载体于16 ℃温育3 h后，导入DH5α菌株的感受态细胞进行37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落于液体LB培养基中，280 r/min，37 ℃摇床培养7 h，取2 μL菌液进行PCR鉴定。选取阳性样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

1.2.3 序列分析 通过使用DNAStar(DNASTAR Inc.,Madison,USA)和DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft,Quebe Canada)软件完成对测序结果的处理。采用Clustal_X version 1.83[22]软件和Mega version 7.0[23]软件对测得序列进行完全比对及绘制亲缘关系树，种子重复数为1 000。分支节点数值为后验概率，大于50%的数值被显示。等借助DNAStar和DNAMAN软件完成。利用NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)数据库的BLAST程序进行同源序列搜索。亲缘关系树绘制所使用的序列信息见表1。

表1 WMV臭椿分离物与其它报道WMV分离物的cp基因的序列同源性

2 结果与分析

2.1 臭椿病叶样品电镜观察结果

新鲜臭椿病叶于透射电镜下进行病毒粒子的负染色观察，可见800 nm×18 nm的线性粒子，病毒粒子外表面无包膜(图2)。

图2 臭椿病叶中的线性病毒粒子Fig.2 Virus particles are flexuous filaments in Ailanthus altissima diseased leaves

2.2 RT-PCR检测结果

利用PVY-legpoty-F/R引物对臭椿病叶的cDNA进行扩增得到约750 bp的特异性片段(图3，泳道1～3)，而健康臭椿中没有检测到该片段(图3，泳道4)。

利用三对引物WMV-5NF/WMV-5NR、WMV-MNF/WMV-MNR和WMV-3NF/WMV-3NR对臭椿病叶的cDNA进行全长基因组的扩增分别得到3 500 bp(图4，泳道1和2)、3 500 bp(图4，泳道4和5)、3 000 bp和750 bp(图4，泳道7和8)的基因组片段，健康植物中无任何条带(图4，泳道3、6和9)。所有阳性条带回收后克隆测序，经拼接得到全长基因组序列。

PVY-legpoty-F/R 引物扩增结果；M：Marker DL2000；1-3：臭椿病叶；4：臭椿健康叶片；5：为水Results amplified by PVY-legpoty-F/R M:Marker DL2000;1～3:Disease leaves of Ailanthus altissima;4:Healthy plants;5:Water图3 臭椿病叶中Potyvirus病毒的RT-PCR检测结果Fig.3 Detected results of Potyvirus of disease leaves of Ailanthus altissima

M：Marker DL15000；1～3：WMV-5NF/WMV-5NR检测结果；4～6：WMV-MNF/WMV-MNR检测结果；7～9：WMV-3NF/WMV-3NR检测结果。1、2、4、5、7和8为臭椿病样;3、6和9为健康植物M:Marker DL15000;1-3:Products amplified by WMV-5NF/WMV-5NR;4-6:Products amplified by WMV-MNF/WMV-MNR;7-9:Products amplified by WMV-3NF/WMV-3NR;3,6 and 9 are healthy plants图4 臭椿病叶的WMV病毒全长基因组的PCR扩增结果Fig.4 Genome of WMV virus disease leaves of Ailanthus altissima full-length PCR fragment amplification results

2.3 序列分析

WMV辽宁盖州臭椿分离物基因组全长为10 070 bp(MF418043)。其编码的多聚蛋白通过蛋白酶的剪接可形成10个小的多肽，从N段到C段依次切割成P1(135-1 466 nt，1 332 bp，444 aa)、HC-Pro(1 467-2 837 nt，1 371 bp，457 aa)、P3(2 838-3 878 nt，1 041 bp，347 aa)、6K1(3 879-4 034 nt，156 bp，52 aa)、CI(4 035-5 939 nt，1 905 bp，635 aa)、6K2(5 940-6 098 nt，159 bp，53 aa)、VPg(6 099-6 668 nt，570 bp，190 aa)、NIa-Pro(6 669-7 397 nt，729 bp，243 aa)、NIb-Pro(7 398-8 948 nt，1 551 bp，517 aa)、CP(8 949-9 797 nt，849 bp，282 aa)。

基于cp基因的氨基酸和核苷酸序列，将辽宁臭椿分离物与国内外报道的WMV分离物进行比对。结果显示，它与北京臭椿分离物同源性最高，氨基酸同源性为93.3%，核苷酸同源性为89.8%。基于cp基因构建系统进化树，WMV的亚洲、欧洲、美洲和澳洲等分离物聚集在一个大分支上，其中，辽宁臭椿分离物与中国北京臭椿分离物WMV-[CN:BJ:Ailanthus altissima](KF274031)最近，结果与同源性比对结果一致。CGMV-[CN:LN](EF611826)作为群外组单独成一个分支(图5)。根据第九次病毒分类委员会报道的Potyvirus分类标准[24-25](cp基因的核苷酸同源性低于76%，或者cp基因的氨基酸同源性低于80%，可认为是PVY属的一个新种)，可判定侵染辽宁盖州地区采集的花叶症状臭椿的病毒是西瓜花叶病毒(WMV)。

图5 基于WMV辽宁分离物及32个已报道WMV cp核苷酸序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on cp nucleotide sequences of WMV Liaoning isolate and 32 previously reported WMV isolates

3 讨 论

臭椿(Ailanthusaltissima)，属苦木科(Simaroubaceae)臭椿属(AilanthusDesf.)落叶乔木，生长迅速，适应性强，容易繁殖，材质优良。由于臭椿在建筑和家具制作、绿化美化(观赏树和行道树)、药用(消炎、杀菌、抗病毒和抗肿瘤等)和生态等方面的应用价值，被广泛种植于中国各地。臭椿叶片特殊臭味具有很强的杀菌除虫功效，因此，它对病虫害抵抗能力较强，受病虫害危害较少。至今，已报道的与臭椿花叶病害相关的病毒仅有WMV[21]、TMV(Tobaccomosaicvirus)[26]和CMV(Cucumbermosaicvirus)[27]。本研究通过病毒粒子的形态观察、基因组全长序列分析和cp基因的同源性分析，首次确定辽宁盖州臭椿花叶病与WMV有关。WMV的自然寄主绝大多数都是草本植物，那么，它是如何避开臭椿较强的抵抗能力，成功在植物体内大量繁殖并引起明显的花叶症状呢？这种适应机制有待进一步研究。

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