PM2．5氧化应激对变应性哮喘气道上皮固有免疫调控因子表达的刺激作用

鲍志坚 胡旭 沈晓强

支气管哮喘是一种由遗传因素和环境因素综合作用引起的，由肥大细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等炎性细胞参与的炎性疾病[1]。其特点是气道高反应性和可逆性气流受限，症状主要是反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽，多在夜间或清晨发作或加剧[2]。根据发病诱因一般将哮喘分为变应性哮喘和非变应性哮喘。变应性哮喘由变应原诱导，表现为嗜酸性粒细胞增多、肥大细胞和Ⅱ型辅助性T细胞激活、IL-4和IL-13等细胞因子大量分泌、免疫球蛋白E水平升高。非变应性哮喘一般主要由大气污染物（如粉尘颗粒、汽车尾气等）、细菌或病毒感染及肥胖等环境因素刺激诱发，与变应原的有无没有直接关系[3-5]。近年来随着环境污染的日益加重，空气中PM2.5的含量已越来越受关注。国内外大量研究显示PM2.5超标能显著提高哮喘患者的发病率及发病次数[6-8]，但具体机制不明确。因此，本研究进一步探讨PM2.5所致的氧化应激对变应性哮喘气道上皮固有免疫调控因子表达的刺激作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康清洁级BALB/c雌性小鼠24只，8～12周龄，体重约20～27g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。卵清蛋白购自美国Sigma公司，批号：A5503；IL-4和IFN-γ的ELISA试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司，货号分别为GWB-1230FC和AF-315-05-100；IL-5和IL-13的ELISA试剂盒购自美国ADL公司，货号分别为LE-07369和LE-06528。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型的制作 采用随机数字表法将小鼠分为哮喘模型组、PM2.5轻度污染组、PM2.5重度污染组和正常对照组4组，每组6只。（1）哮喘模型组：分别于第1、7和14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200μl（致敏液采用50μg的卵清蛋白加入到200μl的磷酸盐缓冲液内溶解所成），于第21天起雾化吸入1%卵清蛋白溶液进行激发，每次持续 30min，1次/d，连续 5d；（2）PM2.5轻度污染组：致敏方法同哮喘模型组，于第21天起吸入PM2.5（90μg/m3）和雾化的1%卵清蛋白溶液进行激发；（3）PM2.5重度污染组：致敏和激发的方式同PM2.5轻度污染组，但吸入气体内PM2.5浓度为200μg/m3；（4）正常对照组：该组小鼠以不含卵清蛋白的饲料进行饲养，分别于第1、7和14天腹腔注射同等体积的磷酸盐缓冲液，激发方法同哮喘模型组[9]。

1.2.2 小鼠血清免疫调控因子水平的检测 实验结束后，处死小鼠，取小鼠血液10ml，静置凝血后取血清，采用ELISA法检测血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。1.2.3 小鼠气道及肺组织的病理学观察 取出小鼠肺脏，灌入10%甲醛溶液，并置于相同溶液中固定，随后进行石蜡包埋切片，常规HE染色。光学显微镜下观察小鼠肺内结构变化情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比较 哮喘模型组和正常对照组血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。PM2.5轻度污染组、PM2.5重度污染组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于哮喘模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。PM2.5重度污染组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于PM2.5轻度污染组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比较（pg/ml）

2.2 各组小鼠气道及肺组织病理学表现 哮喘模型组小鼠气道上皮明显增厚，官腔出现不同程度的狭窄，管壁周围的炎性细胞浸润迹象明显，呈一种典型的哮喘急性期发作的表现，见图1。PM2.5轻度污染组小鼠气道上皮增厚较哮喘模型组更显著，官腔狭窄程度较模型组加重，部分气道痉挛，肺泡腔内分泌物增多，气道管壁周围及血管周围均可见炎性反应，见图2。PM2.5重度污染组小鼠，可以观察到广泛的气道痉挛、收缩或闭塞，气道内柱状上皮显著增厚，官腔明显狭窄，气道管壁周围及肺组织内可见大量的炎性细胞浸润，见图3。

3 讨论

哮喘作为一种以气道反应增高为主要改变的疾病，其致病因素繁多。但当前国内外研究一致认为：哮喘的起病可能是个体生长环境及自身遗传因素综合作用的结果[10]。在哮喘发生、发展的过程中，自身的免疫因素在其中起到了至关重要的作用，其典型的病理表现为气道的反应性增生、气道周围的炎性细胞浸润、气道分泌物增多以及机体的免疫调控因子释放增加[11]。在哮喘的预防措施中，主要是通过避免个体与变应原接触，从而达到降低甚至控制哮喘的发生率的目的。

图1 哮喘模型组小鼠肺组织病理切片（HE 染色，×400）

图2 PM2.5轻度污染组小鼠肺组织病理切片（HE染色，×400）

图3 PM2.5重度污染组小鼠肺组织病理切片（HE染色，×400）

本研究显示哮喘模型组和正常对照组血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比较差异均无统计学意义，说明造模成功后血清中各细胞调控因子间具有可比性。该研究结论与当前大部分研究成果相一致。Chen等[12]通过对健康志愿者与哮喘患者（正常状态下）的血清学指标分析显示，两者血清学指标比较差异均无统计学意义，其认为哮喘发作后体内的大量免疫调控因子，可能是机体通过自身的变态反应分泌的。因此，通过监测哮喘患者血清内的免疫学指标可在一定程度上评估哮喘患者病情的进展程度。

本研究发现随着PM2.5浓度的升高，小鼠体内的各种免疫调控因子均呈显著地上升趋势，且各组间差异均有统计学意义。说明PM2.5在一定程度上能够诱发哮喘的发作，并加重哮喘病情的进展。目前研究认为PM2.5主要作用于非变应性哮喘[13]，PM2.5增加非变应性哮喘发病率的机制可能为PM2.5自身作为一种固体污染物，进入人体后可以直接刺激相应的呼吸道上皮，导致呼吸道上皮黏膜增厚，分泌物增加，因此诱导了哮喘的发生。然而本研究结果却发现其对于变应性哮喘同样有增加发病率的风险。近年来研究认为，PM2.5在空气中并非只以固体颗粒物的形式存在，其自身就能吸附大量的致病菌或蛋白类物质，因此当这些物质随着PM2.5一起被吸入哮喘患者体内之后，会快速地激发气道内自身的固有免疫系统，从而分泌大量的免疫调控物质，以防止外来病原体通过气道黏膜引起机体感染[14-15]。

虽然目前对PM2.5在变应性哮喘患者中的作用尚无共识，但越来越多的研究发现其可诱发变应性哮喘的发生。因此本研究认为PM2.5可增加变应性哮喘患者发病率的风险，其机制可能是通过调节气道自身的固有免疫调控因子实现的，且PM2.5浓度越高，该效应也越明显。

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