龚波 金秀娥 李菁菁 吴晓翠 王峻
摘要:建立了快速测定蜂蜜中金刚烷胺和金刚乙胺药物残留的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。样品用1%甲酸乙腈提取,浓缩后利用超高效液相色谱分离,以乙腈和0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,MRM反应监测模式检测。结果表明,在0.1~100 μg/L的系列浓度范围内均呈良好线性关系,相关系数大于0.999。金刚烷胺检测限为0.2 μg/kg,定量限为0.5 μg/kg,金刚乙胺检测限为0.5 μg/kg,定量限为1.0 μg/kg。在1~20 μg/kg浓度范围内平均回收率为80%~110%,精密度小于20%。该方法方便快捷、定性准确,适用于蜂蜜中金刚烷胺、金刚乙胺药物残留检测。
关键词:蜂蜜;金刚烷胺;金刚乙胺;残留;超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)
中图分类号:S859.84 文献标识码:A
文章编号:0439-8114(2018)24-0136-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.037 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Abstract: A UPLC-MS/MS method was developed and established to raplidly determine amantadine and rimantadine in honey. The sample were extracted with acetonitrile with 1% formic acid. After enrichment,the sample was separated by UPLC,eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 0.1~100 μg/L, and the correlation coefficient were more than 0.999. The detection limit of the amantadine was 0.2 μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg;the detection limit of the rimantadine was 0.5 μg/kg, and the limit of quantification was 1.0 μg/kg. The average recoveries were 75%~110% in the range from 1~20 μg/kg,and the precision was less than 20%. The method was convenient, rapid, accurate and it was suitable for the detection of amantadine and rimantadine in honey.
Key words: honey; amantadine; rimantadine; residues; UPLC-MS/MS
蜂蜜是一种被广泛认知的天然营养食品,富含果糖、葡萄糖、酶、蛋白质、维生素及多种矿物质,具有滋养、润燥、解毒等功效,是中医常用的中药材之一。现代医学研究表明,蜂蜜对肝脏、心脏、高血压以及胃肠道方面的疾病都有治疗和预防的作用[1]。因此,蜂蜜作为药食同源的营养品,被人们广泛应用。但在蜂养殖业中,蜂农为了防止蜂病发生而造成损失,往往会给蜜蜂饲喂抗生素等药物,导致蜂蜜中药物残留的情况愈发严重。2017年,在对湖北部分地区的蜂农走访调查中发现,有蜂农给蜂群饲喂含金刚烷胺、金刚乙胺等成分的药物时有发生。
金刚烷胺(Amantadine,ATD)是饱和三环癸胺的氨基衍生物,是首个被FDA批准的抗流感病毒药物。金刚乙胺是将金刚烷胺的氨基用乙胺基代替得到的药物,该药物作为抗病毒药于1993年被美国批准用于A型流感病毒的预防和治疗作用[2]。但该类药物作用于动物疾病并没有相关数据支持和科学根据。2005年12月,中国农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》,规定列入《兽药地方标准废止目录》(农业部公告第560号)的金刚烷胺、金刚乙胺等及其盐、酯的单、复方制剂停止生产、经营、使用[3]。目前,金刚烷胺、金刚乙胺等抗病毒药物残留检测方法的报道主要集中在血浆和尿液等生物体液、畜禽产品、饲料以及兽药中的非法添加领域[4-6],王彩娟等[7]研究了蜂蜜中吗啉胍药物残留检测,而蜂蜜中金刚烷胺、金刚乙胺等抗病毒药物残留检测方法研究目前仍是空缺。本研究以蜂蜜为基质,研究了金刚烷胺、金刚乙胺两种抗病毒药物残留检测方法,前处理快速简单,灵敏度高,为该药物的残留情况进行检测和排查提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 儀器与试剂
岛津8050液相质谱串联仪;冷冻高速离心机;AE260电子天平,Mettler Toledo公司;涡旋混合器;振荡器;氮吹仪。金刚烷胺(Amantadine,ATD)、金刚乙胺(rimantadine,RTD)与金刚烷胺内标D6均来自于ChromaDex公司;甲醇、乙腈(色谱纯,Tedi);甲酸(色谱纯,J.T.Baker,88%);去离子水(Milli-Q,电阻率18.2 MΩ·cm);高纯氮、高纯氩(纯度均为99.999%)。
1.2 标准溶液配制
混合标准储备液:分别精密称取金刚烷胺、金刚乙胺对照品约10 mg置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100 μg/mL的混合标准储备液。
混合标准中间液:量取混合标准储备液100 μL置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100 ng/mL的混合标准中间液。
内标储备液:精密称取金剛烷胺内标D6对照品约10 mg置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100 μg/mL的内标储备液。
内标中间液:量取内标储备液100 μL置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100 ng/mL的内标中间液。
1.3 样品处理
称取蜂蜜2±0.02 g,置于50 mL塑料离心管内,加适量金刚烷胺内标溶液,加1%甲酸乙腈6 mL,涡旋1 min后加入2 g无水硫酸钠,涡旋振匀,振荡提取10 min。10 000 r/min离心5 min,取上层清液50 ℃氮气吹干。加入乙腈-0.1%甲酸溶液(1∶9)1.0 mL充分涡旋溶解,过0.2 μm滤膜后上机待测。
2 UPLC-MS/MS条件
2.1 超高效液相色谱条件
色谱柱:Xbridge C18(5 μm,2.1 mm×150 mm);流动相:A:0.1%甲酸溶液,B:乙腈,梯度洗脱:0~2.0 min,10%B,2.0~5.0 min,10%B~90%B,6.0~6.1 min,90%B~10%B,6.1~8.0 min,10%B流速0.3 mL/min;进样量10 μL;柱温35 ℃。
2.2 质谱条件
电喷雾离子源ESI(+);接口温度(Interface temperature)350 ℃;DL温度(DL temperature)250 ℃;加热块温度(heatblock temperature)400 ℃;雾化气流速:3.0 L/min;干燥气流速:10.0 L/min;加热气流速:10.0 L/min;多反应监测(MRM采集模式)。各种药物的定性离子对、定量离子对和质谱参数见表1。
2.3 标准曲线、检出限、定量限
精密量取一定量的混合标准中间液,加入适量内标溶液,用乙腈-0.1%甲酸溶液(1∶9)分别配成浓0.1、0.5、2、10、20、100 μg/L的系列基质混合标准工作溶液,使用时现用现配。每个浓度重复3次测定。以分析物与内标物峰面积之比(Y)和分析物与内标物质量浓度之比(X)作线性回归分析,得到回归方程和相关系数(表2)。结果表明,金刚烷胺、金刚乙胺质量浓度在0.1~100 μg/L范围内呈现良好线性关系。采用基质中添加目标化合物的方法,经试验得到特征离子色谱峰信噪比,信噪比≥3的最低浓度即方法的检出限(LOD),信噪比≥10的最低浓度为即方法的定量限(LOQ),其结果见表2。空白基质中添加各药物后得到的特征离子质量色谱如图1、图2所示。
2.4 回收率和精密度
选取空白的蜂蜜样品作为添加回收试验基质,分别进行1、5、20 μg/kg 3个不同浓度的加标试验,每个浓度做6组平行,重复进行3次,结果见表3。在不同加标浓度下,金刚烷胺、金刚乙胺的回收率为80.1%~109.7%,批内RSD≤10%,批间RSD≤10%,能满足目标药物残留的检测要求。
3 小结与讨论
3.1 前处理条件的选择
为了取得更好的萃取效果,比较了乙腈和甲醇2种提取液,发现用乙腈提取的目标物回收率要高于用甲醇提取的回收率。金刚烷胺和金刚乙胺结构中都含有氨基,并且极性较强,采用含酸的有机溶剂更有利于提取[8],因此采用1%甲酸乙腈作为提取液。
比较了MCX固相萃取法、分散固相萃取法以及直接提取法,发现使用MCX固相萃取法、分散固相萃取法时,2种目标物均有较好的提取净化效果;1%甲酸乙腈直接提取法虽然在氮吹浓缩的同时增加了基质效应,但加入内标校正后,基质效应消除,定性、定量分析均能满足试验要求。相比其他2种萃取法,直接提取法更经济并且简单快捷,故本研究采用直接提取法,并加入内标校正。
3.2 质谱及色谱条件优化
金刚烷胺和金刚乙胺结构中均含有-NH2,易形成〔M+H〕+的准分子离子,适合在ESI+模式下扫描,优化后确定目标物的离子对、碰撞能力以及雾化气压力、干燥器温度等质谱分析参数。
采用了乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-2 mmol/L乙酸铵溶液等几种不同的流动相进行色谱分离试验,发现当流动相中含有乙酸铵时对目标物的响应有抑制作用,乙腈-水作为流动相时,目标物峰型较差。当乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时,两种化合物的峰型和响应都能满足要求。
3.3 基质效应
通过以甲醇配制标准工作曲线和用阴性基质液配制的标准工作曲线,结果发现,2种药物均存在不同程度的基质抑制效应。为了减少基质效应对化合物定量的影响,可以加入内标同位素来定量计算。当基质曲线斜率与标准曲线斜率之比在85%~115%之间不存在明显的基质效应,而经过内标校正后的基质曲线与标准曲边斜率之商符合要求,因此采用内标校正,用甲醇直接配制标准曲线。
3.4 小结
通过对样品前处理条件和质谱、色谱条件进行优化,建立了蜂蜜中金刚烷胺、金刚乙胺残留检测的UPLC-MS/MS分析方法。该方法操作简单,检测成本较低,准确度和灵敏度均能满足兽药残留分析要,可用于实际样品检测。
参考文献:
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