转基因技术在家蚕中的应用研究进展

吴凡 李德臣 郝瑜 肖胜武 陈登松

摘要：概括了家蚕（Bombyx mori Linaeus）转基因的方法，综述了转基因技术在家蚕相关领域中的研究进展，展望了转基因技术在家蚕研究上的应用前景。

关键词：家蚕（Bombyx mori Linaeus）;转基因技术;应用;研究进展

中图分类号：S881.2+4         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0015-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.004           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The transgenic methods of silkworm（Bombyx mori Linaeus） were discribed. The research progress of transgenic technology in silkworm was summarized，and the application prospect of transgenic technology in silkworm research was prospected.

Key words： silkworm （Bombyx mori Linaeus）; transgenic technology; application; the research progress

转基因技术发展迅速，作为研究动植物遗传变异和基因功能的主要辅助手段，已经成为生物技术研究的核心领域。家蚕（Bombyx mori Linaeus）作为重要的鳞翅目经济昆虫，在中国具有悠久的历史，自2004年家蚕基因组发布以来，大量基础研究结果的积累使家蚕已经成为研究真核生物基因表达调控的模式生物之一[1-5]。Inagaki等[6]研究发现蚕的药代动力学特征与哺乳动物类似，注入各种肝毒素的化学物质也会在家蚕的血淋巴中触发高丙氨酸转氨酶（ALT）活性，而且绿色荧光蛋白（GFP）转基因家蚕可以通过观察蚕体表GFP荧光强度的减弱对注射的化学物质的时间和剂量进行分析，而不需要连续收集血淋巴，说明家蚕可以作为替代动物模型评价药物引起的组织损伤。家蚕因为具有生命周期短、饲养简单、易于继代等的特点，所以以家蚕作为主要研究对象，利用转基因技术研究真核生物体内基因的表达调控、基因功能和利用外源基因对家蚕的遗传特性进行改良[7]，成为很多学者的关注目标。

1  家蚕转基因方法

转基因技术（Transgene technology）是指采用基因工程技术将人工分离或合成的外源DNA片段转入到特定的生物個体中，与其本身的基因组进行重组，再从中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表达特定遗传性状的个体。该技术可以使重组生物表现人们所期望的新性状，可以利用该技术进行家蚕品种选育研究，培育新的家蚕品种。目前，在家蚕的转基因技术上发展了很多的研究方法，主要有显微注射法、脂质体法、精子介导法、电穿孔法、压力渗透法、基因枪法、扎卵法等，其中显微注射法在家蚕的转基因研究上应用最多。

1.1  显微注射法

显微注射法是利用玻璃微量注射针将外源DNA片段直接注射到原核期胚胎或培养的细胞中，使其在宿主基因组序列中顺利表达，从而获得能稳定遗传的转基因个体的一种转基因技术。利家蚕的显微注射转基因技术是1990年由日本学者Tamura 等[8]建立的，并成功获得了转基因家蚕个体。

Sun等[9]利用RNAi显微注射法获得了具有浓核病抗性的转基因家蚕BDV1-I和BDV2-I，这两个转基因家蚕因浓核病的死亡率分别降低了45%和39%。Zhao等[10]利用胚胎显微注射法将转基因过表达载体BmPGRP-S2转入到家蚕中，获得了转基因家蚕PGRPS2-1和PGRPS2-2，在转基因家蚕中成功表达了BmPGRP-S2，转基因家蚕PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分别降低了36%和32%。Jiang等[11]通过显微注射法将Bmlipase-1增量表达的转基因载体注射家蚕品种大造，获得转基因系统LI-A和LI-B。

1.2  精子介导法

精子介导法是利用精子能瞬间吸收外源DNA的能力，把精子作为外源基因的载体，与外源DNA进行预培养，使精子携带外源DNA，通过受精过程将外源DNA整合于受精卵的染色体中。郭秀洋等[12]构建了质粒pFbGFP，利用精子介导法向家蚕导入质粒，获得了转基因个体，证明该方法可有效导入外源基因。Zhou等[13]将新霉素抗性基因（neo（R））和绿色荧光蛋白基因融合到转座子载体piggyBac上，采用精子介导法转入家蚕中，发现荧光蛋白的表达率为72.7%，Southern印迹分析表明了抗性基因的表达。

1.3  其他方法

脂质体转染法是利用阳离子脂质体表面带正电荷，能通过静电作用将DNA包裹，形成的DNA-脂复合体再被带负电荷的细胞膜吸附，形成一种微囊结构，通过膜的融合作用将外源DNA转入受体细胞。Lee等[14]为了解超声辐射治疗在家蚕上的应用，比较了脂质体转染、超声孔转染、脂质体结合超声孔转染的效率，发现一种荧光素酶表达质粒被转移到刚蜕变的蚕蛹的血腔中，也被转移到其他组织中，荧光素酶活性测定结果显示，脂质体结合超声孔转染的效率是单纯脂质体转染和超声孔转染的6倍。吴雪锋等[15]利用脂质介导法将构建好的家蚕转基因载体piggyBacA3EG转染家蚕培养胚胎细胞SWAU1-BmE，转染后48 h可在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的细胞，RT-PCR检测也能在转染细胞的cDNA中扩增出EGFP片段。

2  转基因技术在家蚕中的应用领域

2.1  家蚕基因功能的研究

转基因技术可以进行基因的过量表达或者是使基因沉默，造成基因功能的缺失，成为研究家蚕基因功能的重要方法之一。Sakai等[16]通过转基因方法在转基因系统内强制表达Masc-R基因，在幼虫阶段造成雌性个体死亡，杂合的转基因雌性个体表达雄性特异蛋白ImpM和Bmdsx，卵巢发育异常，结果表明Masc-R基因主要是决定家蚕雄性。Liu等[17]通过显微注射的方法将构建的转基因表达载体BmAtlastin-n注射到家蚕卵中，获得的转基因家蚕具有BmNPV的抗性，说明BmAtlastin-n对提高家蚕BmNPV的抗性起到重要作用。在家蚕的Bmdsx基因含有一个新的C端，且在家蠶的雄性个体中特异性表达，为确定其C端的作用，Duan等[18]构建了两个家蚕转基因表达系统，使雄性个体中该基因的表达异常，对W染色体进行特异的PCR分析和表型观察没有发现发育异常和性别翻转的现象，定量PCR分析发现在转基因雄性个体中SP1和Vg在脂肪体中的表达上调，PBP在触角中的表达下调，说明Bmdsx基因的C端通过调控下游基因表达而使该基因参与到家蚕的性别发育中。Zheng等[19]用非转座子转基因载体pIZT-B8将含有Orgyia pseudotsugata核型多角体病毒IE2启动子的BBX-B8基因转入到家蚕中，获得了BBX-B8过表达的转基因家蚕，与非转基因家蚕相比，转基因家蚕的发育延迟2.5～3.5 d，雌性个体的茧层量减少4.79%，雄性个体的茧层量减少7.44%，转基因雌性蛹的质量减少6.75%，雄性蛹减少13.83%，结果表明BBX-B8基因对家蚕的发育、丝蛋白的合成和卵的滞育具有重要作用。

Wang等[20]在2A裂解肽的基础上建立了一个多基因表达系统（MGES），通过显微注射法使该系统在转基因家蚕中表达，获得转基因家蚕系统，在转基因家蚕MGES系统可以同时调控多个基因的表达和丝腺靶基因的裂解，且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔物（GSG）可有效提高2A的裂解效率，P2A-GSG成功裂解人造人类血清白蛋白（66 ku）与人酸性成纤维细胞生长因子（20.2 ku）融合基因和家蚕卵黄蛋白受体片段（196 ku）与EGFP融合基因，结果表明MGES系统是进行基因功能研究的有力手段，并为功能性丝制材料在医药、化妆品和其他生物医学领域的利用开拓新的用途。

2.2  生物反应器

与其他动植物相比，家蚕作为生物反应器更具有优势，因为家蚕具有生命周期短，容易饲养，饲养成本低，合成的蛋白量高，而且表达的蛋白纯度高等特点。自从转基因家蚕成功以来，其很快就被发展为生物反应器，生产人类结合蛋白，包括单克隆抗体[21-23]、细胞因子[24，25]和胶原蛋白[26]。Kurihara等[27]以piggyBac为载体构建了丝蛋白H-chain表达系统，在转基因家蚕的蚕茧中产生重组蛋白，由家蚕丝素重链基因启动子调控FeIFN/H-chain融合基因的表达，表明转基因家蚕H-chain表达系统能作为一个产生活性重组蛋白和丝生物材料的平台。

Wang等[28]将重组人酸性成纤维细胞生长因子（r-haFGF）基因转入到家蚕中，利用家蚕的丝腺表达r-haFGF蛋白，获得转基因家蚕系统，且转基因家蚕r-haFGF蛋白的表达量与非转基因家蚕系统相比提高了5.6倍，有利于该蛋白的纯化和大量生产，这一研究结果说明家蚕的丝腺可以有效表达有活力的重组haFGF蛋白。Nikaido等[29]在转基因家蚕的脂肪体中建立了一个鉴定新型类鸦片活性肽μ-受体的配体筛选系统，表达μ-受体-Gi1α融合蛋白，成功鉴定出一个新的结构性复合物，命名为GUM1。Sumitani等[30]为建立家蚕组织特异的细胞死亡系统，用Gal上游启动子序列作为启动子，构建了在特定组织过表达老鼠BAX基因（mBax）的转基因家蚕系统，发现在转基因家蚕内表达的mBax可以诱导家蚕丝腺、脂肪体和感觉细胞的特异性死亡。占鹏飞等[31]通过piggyBac转座子及显微注射方法将Ⅰ型类人胶原蛋白基因（Hcool-I）和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因（BmP4Hα）转入家蚕早期胚胎，这两个基因受丝素轻链基因fib-L启动子驱动，在转基因家蚕幼虫后部丝腺中获得表达。

2.3  家蚕品种的选育

转基因育种技术与传统的育种技术相比具有很多优点，更有利于新品种的选育，如可以打破物种间固有的遗传屏障，克服物种遗传壁垒，可针对目标性状查明决定基因或基因群，利用生物技术将其导入目标群体，快速精准地实现特定性状的改良，缩短育种周期，已成为动植物遗传育种的主要技术手段。随着分子生物学技术和社会经济的发展，蚕业生产上对特殊用途家蚕新品种的需求越来越迫切，传统的育种方法已经不能完全满足蚕业生产发展的需要，加之家蚕基因组框架图的完成，都有力地促进了家蚕转基因育种技术的发展。

Jiang等[11]通过转基因技术获得两个过表达Bmlipase-1的转基因系统LI-A和LI-B，4龄起蚕添食BmNPV后，发现LI-A的死亡率比野生型大造降低33%，表明转基因系统对BmNPV的抗性增强，而且其经济性状没有受到影响。Dong等[32]构建了表达CRISPR/Cas的家蚕转基因系统和以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）为目标的sgRNA，以调节家蚕早期基因的表达，通过G1代杂交获得了4个转基因杂交系，结果证明Cas9（C）/sgRNA（C）转基因系对核型多角体病毒的半致死剂量（LD50）提高了1 000倍，而且杂交后代的经济性状与正常水平无显著差异。刘辉芬等[33]利用DNA重组技术将1 600 bp的人工蜘蛛拖牵丝蛋白基因连接至piggyBac转座子载体，构建蜘蛛拖牵丝蛋白基因表达质粒，成功在家蚕5龄幼虫的后部丝腺中特异性表达人工蜘蛛拖牵丝蛋白基因。李军等[34]利用家蚕资源库中的突变基因，采用系统选育、杂交育种、将目的基因定向导入法等育种手段导入了与活性物质黄酮类产生有关的基因，育成了丝胶茧蚕品种，使该品种产生的丝胶中含有特殊的功能性活性物质。

3  转基因技术在家蚕中的研究展望

随着分子遗传学和分子生物技术的不断发展与进步，越来越多的新技术、新成果不断被应用于遗传育种领域[35]。自从家蚕基因组完成测序以来，家蚕的研究进入了后基因组时代，家蚕基因的表达芯片、蛋白质组、代谢组、遗传变异图谱等陆续获得解析[36]，进一步推动了家蚕转基因技术的发展。利用家蚕转基因技术，在家蚕的产量、质量、抗性等方面累积了大量的转基因素材[37]，开拓了生物反应器，进行了基因功能研究等。转基因技术在家蚕新品种选育及资源的创新利用等方面展现了其他技术无法比拟的优势和潜力，必将为家蚕遗传育种工作的再一次腾飞奠定理论基础，为蚕桑产业的升级发展和拓展应用不断地注入新鲜的血液和活力。

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