孕二烯酮缓释避孕微针含量及其有关物质的测定方法研究

段雪艳 马佳男,2 宁美英* 高云华

1.国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081)；2. 北京协和医学院研究生院；3. 中国科学院理化技术研究所光化学转换和功能材料重点实验室

孕二烯酮是属于19-去甲睾酮系列的第三代孕激素，无雄激素和雌激素活性，表现为较强的孕激素活性，具有良好的避孕效果[1-2]。目前含孕二烯酮的上市产品主要为口服制剂，如美国惠氏公司的上市产品敏定偶就属于复方短效口服避孕药，需要每日服用，顺应性较差[3]。微针是一种新型的透皮给药技术，通过穿刺角质层而将药物输送至皮下，同时又不会触及痛觉神经[4]。溶解微针选用可降解聚合物材料[5-7]，在针体刺入皮肤后，药物随着可降解聚合材料溶解在皮下组织液中，被机体吸收。本课题组以溶解性高分子材料为基质，将孕二烯酮制备成缓释避孕微针，以达到缓释7 d的避孕效果。为了控制微针制剂质量，需要建立灵敏度高、专属性好的孕二烯酮含量及有关物质检测方法。文献报道孕二烯酮的分离及测定方法包括紫外吸光度法[7]和高效液相色谱(HPLC)法[8-10]，本文参考文献方法[9-10]，建立了孕二烯酮缓释避孕微针的药物含量及其有关物质的HPLC测定法，为孕二烯酮缓释避孕微针的体外质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

孕二烯酮原料药(秦皇岛紫竹药业有限公司，批号92801510001)；孕二烯酮缓释微针(自制，批号2017112801,2017112802,2017112803)；孕二烯酮标准品(中国食品药品检定研究院，批号41008-201301)；PVPK30(博爱新开源制药股份有限公司，批号P160307002-1)；PVPK90(博爱新开源制药股份有限公司，批号P160305001-1)；无水乙醇(北京化工厂，批号20151008)；甲醇(fisher scientific，批号110939)；聚乙二醇400(天津市光复精细化工研究所，批号20160611)；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。BT 224 S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Waters 2695-2487高效液相色谱仪(美国Waters公司)；XS105电子天平(METTLER TOLEDO公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；RT 5 power多点加热磁力搅拌器(德国IKA)；KH-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 HPLC条件

色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，UV检测波长为239 nm；流动相为乙腈-水(55:45)，流速为1 ml/min，进样量为20 μl；柱温30℃。

1.3 溶液配制

①对照品储备液的配制：精密称取孕二烯酮对照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀备用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。②供试品溶液的配制：取3片孕二烯酮微针或等量的含药基质溶液，加入10 ml乙醇，室温搅拌30 min，滤过，取100 μl续滤液于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为孕二烯酮供试品溶液。③自身对照溶液的配制：精密量取孕二烯酮供试品溶液100μl于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为自身对照溶液。④损失供试品溶液的配制：制备孕二烯酮缓释微针后，将残留含药高分子基质溶液的枪头置于锥形瓶中，加入10 ml乙醇，室温搅拌30 min，滤过，取50 μl续滤液于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为损失供试品溶液。

1.4 专属性

1.4.1阴性干扰试验分别称取3片空白微针基质和孕二烯酮缓释微针，加10 ml乙醇，密封，超声提取30 min，取100 μl续滤液，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20 μl注入液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图。

1.4.2强降解试验取载药微针适量，分别在下述条件下进行实验。①酸破坏： 加1 mol/L盐酸1 ml使其溶解，室温放置24 h后加适量0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节至中性，经0.45 μm滤膜滤过，取适量续滤液加流动相稀释，摇匀待测。②碱破坏: 加1 mol/L氢氧化钠1 ml使其溶解，室温放置24 h后加适量0.1 mol/L盐酸溶液调节至中性，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液加流动相稀释，摇匀待测。③氧化破坏:加3%过氧化氢溶液适量使其溶解，室温放置8 h后，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液加流动相稀释，摇匀待测。④高温破坏:于100℃烘箱中24 h，取出后放至室温，加入适量乙醇使其溶解，取续滤液加流动相稀释，摇匀待测。⑤光照破坏:置于(4500±500)Lx光照条件下48 h，取出后加入适量乙醇溶解，取续滤液加流动相稀释，摇匀待测。

1.5 线性范围

精密称取孕二烯酮对照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度备用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流动相稀释至刻度，作为储备液。分别取储备液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀、滤过，取续滤液20 μl进行HPLC 测定，以待测组分峰面积(A)对浓度(C， μg/ml)进行线性回归。

1.6 精密度

精密称取孕二烯酮对照品适量，配制高、中、低3个浓度的溶液(1.0,4.0和10.0 μg/ml)，分别进样，观察色谱图，记录峰面积，计算样品的日内和日间精密度。

1.7 稳定性试验

精密取孕二烯酮对照品适量，配制成一定溶度的溶液，分别于常温保存24 h和4 ℃冰箱保存72 h，在上述色谱条件下进样，观察色谱图，记录峰面积，考察样品在不同储存条件下的稳定性。

1.8 重复性试验

精密取孕二烯酮对照品适量，配制成一定溶度的溶液，连续进样6次，观察色谱图，记录峰面积，计算孕二烯酮峰面积的RSD，考察仪器的精密度。

1.9 定量限和检出限

按照信噪比3:1和10:1时相应浓度的量进样测定，测定孕二烯酮的定量限和检出限。

1.10 回收率试验

取3片空白微针，按照高、中、低剂量分别精密加入孕二烯酮对照品6.0，7.5，9.0 mg(分别相当于处方量的80%，100%和120%)，每组平行3份，加10 ml乙醇，于室温搅拌30 min，滤过，移取续滤液50 μl于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，取20μl进样，记录峰面积，计算回收率。

1.11 含量测定

取3批孕二烯酮缓释避孕微针、含药基质溶液，分别按照方法1.3制备供试品溶液；同时制备损失供试品溶液，取20 μl提取液进样，记录峰面积，根据外标法计算孕二烯酮缓释避孕微针的标示含量，计算公式=M测定/(M基质-M损失)×100%。

1.12 有关物质测定

取3批孕二烯酮缓释避孕微针，按照方法1.3制备孕二烯酮供试品溶液和自身对照溶液，采用方法1.2色谱条件，精密进样自身对照溶液20 μl，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的20%，分别将供试品和自身对照溶液精密进样20 μl，记录色谱图至主成分保留时间的2倍，按照自身对照法计算3批孕二烯酮微针杂质总含量。

2 结果

2.1 专属性

2.1.1阴性干扰试验HPLC结果(图1)表明，辅料对孕二烯酮的测定无干扰。

2.1.2强降解实验图2可以看出，A、B、C、D、E保留时间的色谱峰为含药微针经过破坏后出现的新的降解产物，各杂质峰与主峰之间分离良好；F保留时间的色谱峰为空白微针经过破坏后出现的新降解产物，但不影响孕二烯酮及其有关物质的测定。表明该方法专属性良好。

2.2 线性范围

线性回归方程为：A=63605C+233.82，r=0.9997。结果表明，孕二烯酮在(0.5 ～ 10.0)μg/ml线性范围内线性关系良好。

2.3 精密度

日内精密度分别为0.10%,0.10%和0.12%，日间精密度分别为0.28%,1.47%和0.99%，仪器的精密度良好。

2.4 稳定性

常温保存和4℃冰箱保存的RSD分别为1.96%和0.40%，表明样品于常温24h和4℃冰箱保存72 h的稳定性良好。

2.5 重复性

孕二烯酮峰面积的RSD为0.53%，表明仪器的重复性良好。

2.6 定量限和检出限

孕二烯酮的定量限和检出限分别为7.5ng/ml和2.5ng/ml。

2.7 回收率

孕二烯酮的回收率分别为96.88%，97.11%和101.3%，RSD分别为0.52%，1.68%和0.06%，平均回收率为98.4%。

2.8 含量测定

3批孕二烯酮微针的实际含量为标示含量的94.26%,101.40%和101.00%。

2.9 有关物质测定

3批孕二烯酮缓释微针的杂质总含量分别为0.14%，0.15%和0.12%，均<1.00%。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

孕二烯酮几乎不溶于水，在甲醇和乙醇等有机溶剂中的溶解性较好。从环保和经济角度考虑，采用乙醇为孕二烯酮微针的提取溶剂。本实验结果表明，采用乙醇进行药物提取，微针中孕二烯酮的回收率在96.88%～101.30%范围内。

3.2 提取方法的考察

本实验考察了超声提取和磁力搅拌提取两种方式、提取溶剂、提取时间和提取体积对孕二烯酮的含量和有关物质测定的影响。结果表明：磁力搅拌提取效率高于超声提取，所以选择磁力搅拌提取方式；乙醇和乙腈的提取效率相同，从经济和环保角度选择乙醇为提取溶剂；提取时间30 min高于15 min的提取效率，但是30min后的提取效率几乎没有变化，因此选择提取时间为30 min；10 ml和20 ml乙醇的提取效率相同，且显著>5 ml的提取效率，因此选择溶剂体积为10 ml。最终采用供试品中加入10 ml乙醇，密封，室温下磁力搅拌30 min的提取方法为最佳提取方法。

3.3 测定方法的优化

本研究通过紫外全波长扫描确定了孕二烯酮的最大吸收波长为239 nm；参阅文献并结合预实验，选择具有柱压低、选择性好、可以改善峰形的乙腈作为有机相。通过考察不同组成比例的乙腈与水对主成分测定的影响，结果表明，乙腈：水的比例为55:45时，孕二烯酮色谱峰的保留时间和峰形为最佳。线性、精密度、稳定性和重复性等方法学的考察结果表明，该HPLC方法专属性强，灵敏度高，且操作步骤简便快速，可以同时测定含量和有关物质，为孕二烯酮缓释避孕微针的进一步研究和开发提供依据。

3.4 含量测定

文献中尚无有关缓释微针的含量和有关物质测定方法的报道，本文对孕二烯酮缓释避孕微针的药物含量的测定进行了研究。微针的含量计算不同于其他制剂以往的测定方法，因为微针基质材料加入定量溶剂后，由于高分子材料的溶胀特性，基质溶液的体积会大于定量加入的溶剂体积量，导致基质溶液的实际浓度降低。此外，由于缓释微针制备过程中会有一部分基质溶液残留在移取器中，损失率约为50%。所以在含量测定过程中应考虑这两个因素，否则影响缓释微针制剂质量研究的准确性。

本研究对于孕二烯酮缓释避孕微针的含量和有关物质研究是首例，且对于以具有溶胀性的材料为基质的微针制剂的质量控制研究具有重要的指导意义，为微针制剂的进一步研究奠定了重要的科学基础。