PBX3在宫颈癌中的表达及与临床病理参数和预后关系

杜昌宇

广西壮族自治区柳州市妇幼保健院(545000)

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，死亡率较高[1]。宫颈癌发生发展受到较多因素的影响，病毒感染、多个性伴侣、多产、初次性生活<16岁、吸烟等均为宫颈癌的高发因素[2]。近期研究发现，宫颈癌组织中有关基因发生改变可导致宫颈癌的发生，因此探究宫颈癌的发生机理对于寻找宫颈癌治疗靶点具有十分重要的积极意义[3]。前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)属PBX家族成员之一，在白血病研究中较多。近期研究显示，其在胃癌等肿瘤中分子表达量明显高于癌旁组织，且与患者肿瘤转移、侵袭、迁移有关[4]。但目前在宫颈癌中未见研究。本研究通过探究PBX3在宫颈癌组织的表达及临床意义，为治疗宫颈癌提供新靶点提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2012年3月—2015年3月手术治疗的宫颈癌组织及癌旁组织。纳入标准：①均经术后病理证实；②术前未经放疗、化疗或其它肿瘤相关治疗；③临床资料、术后随访资料完整。排除标准：①合并其它肿瘤；②代谢异常性疾病；③急性心、脑血管疾病者；④肺、肝、胆、肾等重要器官发受损。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

蛋白提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；PVDF膜购自Thermo Fisher Scientific公司；电泳仪购自美国Beckman公司；Nanodrop蛋白测定仪器购自德国NanolytiK公司；显微镜购自olympus公司。

1.3 检测方法

1.3.1蛋白免疫印迹(WB)分析使用RIPA蛋白提取试剂裂解组织提取蛋白质， 4℃ 12000g离心10min， 12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，蛋白凝胶转移到PDVF膜上,封闭1h，添加PBX3一抗(1:500)4℃孵育过夜，添加二抗室温下孵育1h。以β-actin蛋白表达作为内参，采用Quantity One软件评估蛋白相对表达水平。

1.3.2免疫组织化学分析常规制备石蜡组织切片(4μm)，二甲苯脱蜡，梯度浓度酒精脱水。将切片置于柠檬酸钠溶液孵育20min，3%过氧化氢孵育10min，10%正常山羊血清中孵育30min，添加PBX3一抗4℃孵育过夜；添加生物素化的二抗孵育30min，添加链霉亲和素过氧化物酶孵育15min。磷酸缓冲液洗涤后，添加100μl DAB溶液，显微镜下观察直至显色；水洗后添加苏木精复染，氨水反蓝后自来水冲洗。切片乙醇脱水二甲苯中透明。

1.3.3评分标准PBX3蛋白定位于细胞质，染色后阳性表达呈棕色颗粒。染色强度由两名资深病理学医师以半定量法[5]评分，主要从染色强度和阳性细胞百分比评定[10]。①阳性细胞数分级：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。②染色强度分级：阴性为0分，弱度为1分，中度为2分，强度为3分。两个分数相乘计算最终得分：≥6分为阳性，<6分为阴性。

1.4 随访

对患者进行30个月随访。在本院长期治疗、复查病例详细登记；不在本院复查患者采用电话随访。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 研究对象基本情况

共纳入资料82例，年龄(51.5±5.4)岁(36～60岁)；鳞癌68例、腺癌14例；组织高分化39例，中分化26例，低分化17例； TNM分期为Ⅰ期39例，Ⅱ期23例，Ⅲ期20例；有淋巴结转移24例，无淋巴结转移58例。

2.2 PBX3在宫颈癌组织中蛋白表达

PBX3蛋白表达宫颈癌组织(0.95±0.11)高于癌旁组织(0.18±0.03)(t= 60.154，P=0.000)。见图1。

图1 PBX3蛋白表达

2.3 在宫颈癌组织中PBX3蛋白阳性表达

宫颈癌组织中PBX3蛋白阳性表达率(38.8%，31/82)高于癌旁组织(30.0%,18/82)(χ2= 4.919，P=0.027)。见图2。

图2 PBX3蛋白阳性表达(200×)

2.4 PBX3表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系

宫颈癌患者82例中，PBX3蛋白阳性表达31例，阴性表达51例。PBX3表达与患者年龄、病理类型、肿瘤浸润深度无关(P>0.05)，与肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润程度淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织 PBX3表达与临床病理参数的关系

2.5 影响宫颈癌患者预后的COX回归分析

82例均随访30个月，30人死亡，死亡率为36.6%。将临床病理参数纳入COX回归分析，单因素结果显示年龄、肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润程度、淋巴结转移、PBX3表达为影响患者预后的因素；多因素分析显示，肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、PBX3为影响患者预后的独立因素。见表2。

表2 影响宫颈癌患者预后的COX回归分析

2.6 PBX3表达与预后的关系

PBX3阳性表达31例中18例(58.1%)死亡；阴性表达51例中12例(23.5%)死亡。Kaplan-Meier生存曲线显示，PBX3阳性或阴性表达患者总体生存率存在差异(P<0.05)。

图3 PBX3表达与宫颈癌患者预后的关系

3 讨论

宫颈癌属于临床常见妇科肿瘤，发生机制目前尚不明确。多数认为其发生发展属于多因素、多步骤过程，是多种基因、蛋白共同作用的结果[6-7]。为寻找宫颈癌诊断、治疗的有效分子标志物，本研究检测PBX3在胃癌中的表达以及与患者临床病理参数的关系，以期为宫颈癌的诊断、治疗提供一定的参考。

PBX3为PBX家族成员之一，在细胞发育、进化中发挥重要功能。有研究显示其与原癌基因功能相同，当基因异常表达时诱发肿瘤的发生[8]。在结肠癌研究中发现，过表达PBX3后能够增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力，其机制与激活MAPK信号通路磷酸化水平有关[9]。在前列腺癌研究中显示，PBX3在前列腺肿瘤中呈高表达，且为Let-7d分子的靶基因，经Let-7d调控后增加PBX分子表达促进肿瘤的发生[10]。Han等研究发现，PBX3为miR-33a-3P的靶基因，其能够直接抑制PBX3进而抑制人肝癌细胞迁移、侵袭[11]。基于PBX3在其它肿瘤中的作用，本研究推测其在宫颈癌中可能也具有一定的作用。经过分子生物学检测发现，与癌旁组织相比，宫颈癌组织中PBX3蛋白、蛋白阳性表达率均升高，这与在卵巢癌、多发性骨髓瘤细胞[12-13]中报道相一致，说明PBX3在宫颈癌中可能发挥促癌基因的作用。

为进一步明确PBX3蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系，本研究结果显示,PBX3表达与年龄、病理类型、肿瘤浸润深度无关，与肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润程度淋巴结转移有关。提示随着PBX3蛋白表达的升高，宫颈癌肿瘤恶性程度越高，病情进展快，进一步促进癌细胞的转移。这些结果均显示PBX3参与宫颈癌的发生、发展，且与肿瘤的恶性程度、转移等密切相关，对肿瘤的发生发展起着促进调节的作用。

有研究显示，除家族史、流产次数、吸烟等外，分子遗传因素也为宫颈癌发生的高危因素[14-15]。在前列腺癌研究中发现，高水平PBX3为前列腺发生的高风险因子，在前列腺诊断中有一定预测价值[16]。本研究单因素分析显示，年龄、肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润程度、淋巴结转移、PBX3表达可能为影响患者预后的因素；多因素分析显示，肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、PBX3为影响患者预后的独立因素。提示PBX3表达升高为宫颈癌危险因素。

宫颈癌不能完全根治，患者2年内复发率较高。有调查显示，复发者平均生存期仅为7个月，探究影响其预后的有效生物学指标，对其预测、治疗十分重要[17]。PBX3表达水平与患者预后密切相关。PBX3异常表达导致其蛋白功能改变，进而引发癌变，影响患者预后。在急性髓细胞白血病研究中显示，PBX3为患者预后不良的重要因素，且高表达者预后不良[18]。结肠癌研究中发现，PBX3高表达者生存期明显低于低表达者，患者预后较差[19]。本研究PBX3阳性表达者30个月累计生存率明显低于阴性表达者生存率，两组Kaplan-Meier生存曲线对比具有差异性，提示PBX3表达与患者预后相关，且高表达者预后不良。

综上所述，PBX3在宫颈癌中发挥着促肿瘤进展的作用，在宫颈癌中呈高表达，与淋巴结转移、肿瘤分期、浸润深度等相关，并且为宫颈癌发生的独立危险因素，与患者不良预后有关。但由于宫颈癌的发生发展为多因素、多阶段过程，本研究仅从临床角度探究其表达意义，而有关PBX3分子机制研究仍需深入研究，为宫颈癌的预防和治疗提供新的参考。