金荞麦药酒对胶原诱导关节炎大鼠凋亡基因及基质蛋白酶的影响

潘朝旺 王 伟 万进军

(鄂州职业大学医学院药学系，湖北 鄂州 436000)

王庆等〔1〕研究表明老年风湿性关节炎患者自我管理行为与自我效能有明显相关性，但药物治疗具有更重要的地位。金荞麦具有清热解毒，润肺补肾，健脾止泻，祛风湿之功效。本实验研究金荞麦药酒对Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)模型大鼠血清基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、滑膜细胞相关凋亡基因caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达、脾脏淋巴细胞凋亡率及膝关节滑膜巨噬细胞密度的影响。

1 材料与方法

1.1动物 18月龄雌性SD大鼠80只，体重(390±30)g，SPF级，由三峡大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2011-0012。

1.2药品与试剂 本实验所用金荞麦2014年3月购于湖北省鄂州市中医院，经鄂州市药品检验所郑本瑞主任药师鉴定为蓼科植物金荞麦Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara的干燥根茎，符合《中华人民共和国药典》2010年版标准。金荞麦药酒，淡黄色液体，本院自制，将金荞麦饮片与白酒以4∶11(g∶ml)比例常温浸泡60 d，倒出液体，用白酒调节至每毫升药酒相当于金荞麦原药材0.4 g，本实验剂量以原生药表示，临用前用生理盐水稀释成不同浓度；雷公藤多苷片，浙江得恩德制药有限公司生产，批号：20131114；完全弗氏佐剂(FCA)、鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)，Sigma 公司；Trizol试剂，RNA逆转录试剂盒，SYBR Premix Ex Taq 试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；大鼠血清MMP-2、MMP-9酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒，卡迈舒(上海)生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，天津百浩生物科技有限公司；ED1单抗(标记巨噬细胞)，上海今迈生物科技有限公司；SP免疫组织化学检测试剂盒，上海研卉生物科技有限公司；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.3仪器 9602A酶标仪，南京普朗医用设备有限公司；超声波细胞粉碎机，上海豫明仪器有限公司；台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器公司；Z160M微量高速离心机，德国HERMLE；CFX 96 Touch PCR仪，美国伯乐；PT-MR3100D组织匀浆机，瑞士Polytron公司；UV754紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；病理切片机HS2046，金华市华速科技有限公司；OLYPUS BX-60光学显微镜，日本；PV-200 型足容积测定仪，成都泰盟科技有限公司。

1.4动物造模及分组给药 随机抽取大鼠10只，为正常组，其余50只建立CIA模型〔2,3〕，将CⅡ溶于0.2%醋酸，浓度为2 mg/ml，4℃条件下放置过夜，与等体积FCA混合，于冰浴中充分乳化，即得CⅡ乳剂，于每只大鼠尾根部、背部、右后肢足趾3点皮内共注射0.4 ml，正常组于相同部位3点注射生理盐水0.1 ml。7 d后所有造模大鼠按原方法注射CⅡ乳剂0.2 ml加强免疫1次。将造模大鼠随机分为模型组、阳性对照组、高剂量金荞麦组、中剂量金荞麦组、低剂量金荞麦组。正常组、模型组于造模后每天灌胃生理盐水15 ml/kg，阳性对照组每天灌胃雷公藤多苷混悬液0.03 g/kg，高、中、低剂量金荞麦组分别每天灌胃不同浓度金荞麦药酒2.16、1.08、0.54 g/kg，灌胃体积为10 ml/kg，连续给药21 d。

1.5观察指标及方法 观察记录致炎后第12、15、18、21天各组大鼠左后足跖肿胀体积。末次给药2 h后，常规对各组大鼠眶静脉取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液于-70℃保存待用。ELISA测定血清MMP-2、MMP-9水平。

1.6RT-PCR检测滑膜细胞凋亡相关基因caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表达 取大鼠后肢右膝关节，分离出滑膜，常规Trizol法提取滑膜细胞总RNA，检查纯度和浓度达到要求后，按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。根据上海捷瑞生物工程有限公司提供的caspase-3、caspase-9、β-actin核苷酸序列设计和合成引物，按SYBR Premix Ex Taq 试剂盒说明添加PCR反应体系，进行caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA的cDNA扩增，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性15 s，60℃退火60 s，40个循环结束。RT-PCR数据处理采用2-ΔΔCt法。

1.7流式细胞术检测脾脏淋巴细胞凋亡 取大鼠脾脏，称重后剥离干净，生理盐水冲洗，取加磷酸盐缓冲液研磨，过100目筛，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，向沉淀中加适量红细胞裂解液，混匀后静置5～6 min，再1 000 r/min离心10 min，用1640完全培养液(加入10%胎牛血清)重悬细胞，调整细胞浓度2×106个/ml，取上述液体0.1 ml按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测分析。

1.8膝关节滑膜ED1免疫组化染色及巨噬细胞计数 取大鼠后肢左膝关节，分离膝关节皮肤、肌肉等组织，暴露膝关节，固定，用手术剪沿髌骨周围将整块滑膜剪成条状，立即用10%甲醛液固定，石蜡包埋切片，SP染色法进行ED1免疫组化染色(ED1单抗浓度为1∶20)，AEC显色，显微镜下观察滑膜衬里层ED1阳性细胞分布密度(细胞数/mm2)。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组足跖肿胀体积比较 与正常组比较，模型组自第12天起有明显肿胀(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和金荞麦各剂量组肿胀体积下降，自第15天起基本上差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2各组血清MMP-2、MMP-9水平比较 与正常组比较，模型组MMP-2、MMP-9水平升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和高、中剂量金荞麦组MMP-2、MMP-9明显下调(P<0.05，P<0.01)，低剂量金荞麦组MMP-9也明显下调(P<0.05)。见表2。

2.3各组滑膜细胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比较 与正常组比较，模型组caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和高、中剂量金荞麦量组caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表达明显上调(P<0.01)，低剂量金荞麦组caspase-9 mRNA表达也明显上调(P<0.05)。见表2。

表1 各组足跖肿胀体积比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 各组血清MMP-2、MMP-9水平及滑膜细胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比较

2.4各组脾脏淋巴细胞凋亡水平比较 与正常组比较，模型组脾淋巴细胞凋亡率明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和高、中剂量金荞麦组脾淋巴细胞凋亡率明显升高(P<0.05，P<0.01)，低剂量金荞麦组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.5各组膝关节滑膜巨噬细胞水平比较 与正常组比较，模型组巨噬细胞密度明显升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和高、中剂量金荞麦组巨噬细胞密度明显降低(P<0.05,P<0.01)，低剂量金荞麦组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组脾脏淋巴细胞凋亡、膝关节滑膜巨噬细胞水平比较

3 讨 论

MMPs可降解软骨和关节骨中的蛋白多糖、胶原等细胞外基质大分子，从而促进血管翳对软骨的侵袭，引起韧带、软骨、骨的破坏〔4，5〕。MMP-2和MMP-9作为明胶酶类基质金属蛋白酶，两者作用底物近似，对间质胶原、明胶、弹性蛋白、和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型胶原等细胞外基质成分有降解作用〔6，7〕。在所有MMPs中，MMP-2表达最广泛，对结缔组织的生理代谢具有重要意义，过度表达可导致关节炎的发生，应用MMPs抑制剂可以阻止关节的破坏已经在动物实验中得到证实〔8〕。本实验表明，金荞麦药酒可降低CIA大鼠血清MMP-2和MMP-9水平，从而抑制软骨和关节骨中细胞外基质降解。线粒体途径是细胞凋亡的经典途径之一，在凋亡刺激因子作用下，细胞色素C释放，与凋亡蛋白激活因子结合，形成多聚复合物，导致caspase-9活化，后者再活化下游的caspase-3，引发级联反应，分解大量的细胞底物，最终导致细胞凋亡〔9〕。升高caspase-3水平可以促进RA大鼠增生的滑膜细胞凋亡。本实验表明，金荞麦药酒可增强CIA大鼠滑膜细胞caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达，促进增殖的滑膜细胞凋亡，改善风湿性关节炎的病理状态。在风湿性关节炎患者病变关节滑膜内，巨噬细胞数量明显增多，其不仅与关节疼痛数、压痛数、红细胞沉降率、C 反应蛋白等反映风湿性关节炎病情程度的指标呈明显正相关，还与X线关节破坏的侵蚀积分和狭窄积分呈明显的正相关，可能与其释放肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6等炎性因子有关。本实验同时显示，风湿性关节炎大鼠脾淋巴细胞凋亡率较正常大鼠明显降低，其机制有待进一步研究。

1王 庆，徐桂华，钱 先，等.老年类风湿关节炎患者自我管理行为与自我效能的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(16):4684-5.

2徐 琦，尹抗抗，谭达全，等.麻黄加术汤对大鼠类风湿性关节炎模型作用机制的研究〔J〕.湖南中医药大学学报，2011;31(5):13-5.

3马艳苗，王永辉，李艳彦，等.风湿宁胶囊对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞超微结构及细胞凋亡相关基因表达的影响〔J〕.中医杂志，2013;54(4):326-8，335.

4许 蕾，解思涛，谭 磊,等.中西医治疗类风湿关节炎的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(5):1436-7.

5马 玲.糖皮质激素在调节类风湿关节炎患者多项血清因子中的效果观察〔J〕.医学理论与实践,2015;28(11):1423-5.

6Kim KS，Choi HM，Lee YA，etal.Expression levels and association of gelatinases MMP-2 and MMP-9 and collagenases MMP-1 and MMP-13 with VEGF in synovial fluid of patients with arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2011;31(4):543-7.

7Nyman JS，Lynch CC，Perrien DS，etal.Differential effects between the loss of MMP-2 and MMP-9 on structural and tissue level properties of bone〔J〕.J Bone Miner Res，2011;26(6):1252-60.

8Ishikaw T，Nishigakia F，Miyata S，etal.Prevention of progressive joint destruction in adjuvant induced arthritis in rats by a novel matrix metalloproteinase inhibitor，FR217840〔J〕.Eur J Pharmacol，2005;(508):239-47.

9林昌松，陈秀敏，林 云.昆母汤醇提液对人类风湿 关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡及caspase-3表达的影响〔J〕.广东医学，2015;36(3)：339-41.