PDGF-BB/BMP-2影响种植体周围骨形成作用的组织学观察

周万琳，李琳琳，刘润喆，李美华*

(1.吉林大学第二医院 口腔科，吉林 长春130041；2.吉林大学中日联谊医院手术室)

种植体周围良好的骨结合水平是种植体稳定行使功能及维持长期疗效的关键，种植体植入后其周围新骨的形成影响着骨结合水平。机体骨形成是多种骨形成细胞与各类骨生长因子彼此协调作用的过程。作为骨形成的主要功能细胞，成骨细胞通过形成矿化结节以形使成骨功能，矿化结节的形成是骨组织分化成熟的标志。茜素红染色法通过茜素红与矿化结节中钙盐的显色反应，从而观察骨组织钙盐沉积情况[1]。Mason染色则通过对骨组织中胶原纤维的显色以体现骨质的成熟程度。目前，随着国内外学者对骨生长因子的研究，血小板衍生性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)在骨形成过程中的作用的达成了一定的共识[2]，但就PGGF和BMP对种植体周围骨形成作用的研究与论著仍相对较少。本研究的目的在于利用茜素红染色法及Masson染色法，观察PDGF-BB/BMP-2及二者协同对种植体周围成骨作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1研究对象 采用新西兰白兔24只，无雌雄限制，体重2-2.5 kg，所有实验对象术区无创伤及感染，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心统一管理。

1.1.2实验器械 无菌手术巾、无菌手术手套及手术衣、手术刀、刀柄、眼科剪、骨膜剥离器、缝线、线剪、纱布、注射器、标本瓶。

1.1.3实验仪器 种植体(北京莱顿公司)、种植机(日本 NSK Surgic XT Plus)、负压吸引器(YX932D 上海无相仪器仪表有限公司)、显微镜(OLYMPUS BX52)、数码相机(OLYMPUS SP610)。

1.1.4实验试剂 水合氯醛(中国医药上海化学试剂公司)、PDGF-BB及BMP-2(peprotech Company,USA)、丽春红酸性复红染液(上海鼎国生物技术有限公司)、茜素红染液(吉林大学白求恩医学部病理实验室)。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型的制备 (1)水合氯醛麻醉家兔，备皮、消毒、铺单。沿髂骨下缘切开皮肤，逐层分离，暴露双侧髂骨。术中保证低温生理盐水降温，球钻平整骨面，逐级备洞，植入种植体，严密缝合肌层及皮肤。(2)将兔子随机分为4组，每组6只，分别给予BMP-2、PDGF-BB、BMP-2+PDGF-BB及NaCl阴性对照组，保证给药途径及给药时间一致，术后4组动物食饲相同。

1.2.2标本处理 设置3天、7天、10天为观察节点，空气栓塞法处死家兔。种植体及周围组织于中性福尔马林固定一周，常规石蜡包埋，切片。

1.2.3Masoon染色 组织切片XY脱蜡水化，Weigert氏铁苏木精染核7分钟，充分水洗，盐酸酒精分化数秒，返蓝，水洗；丽春红酸性复红染液染色7分钟，0.2%HOAc浸洗片刻，1%pma分化4分钟；0.2%冰醋酸浸洗后，亮绿染色7分钟；0.2%HOAc浸洗片刻，脱水,XY透明后中性树胶封固。

1.2.4茜素红染色 组织切片XY脱蜡水化，PBS涤洗(共3次，每次5 min)；甲醛固定后茜素红染液染色5 min，快速脱水,XY透明后中性树胶封固。

2 结果

2.1 Masson染色结果

NaCl对照组，3天时种周围组织中可见胶原纤维呈绿色，7天、10天时纤维数量增加(图1)；BMP-2组，3天时可见绿色纤维略少于对照组，7天、10天时可见纤维数量增多(图2)；PDGF-BB组与对照组相比，3天时较可见多量绿色纤维，随实验进行显示纤维增多，修复能力增强(图3)；BMP-2+PDGF-BB组与对照组相比，3天时可见绿色纤维略少，7天、10天时则可见胶原纤维数量变多、修复的能力增强，且高于BMP-2组(图4)。

图1 NaCl组各时间段纤维修复情况(标尺示50 μm)

图2 BMP-2组各时间段纤维修复情况(标尺示50 μm)

图3 PDGF-BB组各时间段纤维修复情况(标尺示50 μm)

2.2 茜素红染色结果

可见0.9%NaCl阴性对照组的钙盐矿化水平随实验时间延长无显著变化；而PDGF-BB组与BMP-2组的钙盐沉积水平均随实验时间延长而降低，且PDGF-BB组钙盐矿化水平降低显著高于BMP-2组；BMP-2+PDGF-BB组的钙盐沉积水平较NaCl对照组略有降低(图5)。

图4 BMP-2+PDGF-BB组各时间段纤维修复情况(标尺示50 μm)

图5 各组的钙盐沉积情况情况(标尺示50 μm)

3 讨论

种植体周围骨结合被认为是骨组织对种植体的一种结构性反应，从类骨质形成到最终钙化为成熟骨组织需要经历多个阶段[3]。成骨细胞、破骨细胞等骨形成细胞是这一过程的主要功能单位，但目前认为机体内各类骨生长因子在调节骨形成的作用体系中占据主导作用。BMPs是一族广泛分布于骨基质中的低分子酸性糖蛋白多肽，其成员包括BMP-2、BMP-4及BMP-7等。其中BMP-2被认为具备稳定的诱导成骨效果，其机制主要是通过显著增强细胞内碱性磷酸酶活性，以诱导成骨细胞表型表达，改善I型胶原纤维及骨钙素的表达水平，从而发挥促骨形成作用[4]。良好的血运是骨组织形成、改建的关键，PDGF不仅能够诱导骨祖细胞分化增殖，还能上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达以刺激血管形成，从而发挥促进骨组织再生的作用[5]。

本研究中，茜素红染色结果表明随着实验时间的延长，实验组较对照组均出现钙盐矿化、沉积的减少，考虑可能为种植手术引起周围骨组织存在小范围变性坏死，机体激活宿主防御机制，因而存在更多活跃的破骨细胞与多核巨噬细胞，多认为这一现象是成骨细胞为类骨质形成清除障碍，进而加速骨改建进程。从Masson染色结果可以观察到，在7天、10天时，BMP-2组与PDGF-BB组的白纤维较0.9%NaCl对照组均有增加，且PDGF-BB组绿染的白纤维数量略多于BMP-2组，而茜素红染色结果则显示在7天、10天时BMP-2组钙盐沉积程度略优于PDGF-BB组，表明可能PDGF-BB在骨形成早期的胶原纤维修复中发挥更优作用，而BMP-2则多作用于稍晚期的骨质矿化、成熟过程。同时可以观察到，BMP-2+PDGF-BB组在7天、10天时，无论胶原纤维数量还是钙盐沉积、矿化程度均优于BMP-2组与PDGF-BB组，表明这两种生长因子在骨修复、形成早期具备一定的协调、促进效应。

本研究主要通过建立兔髂骨种植模型，从组织病理学角度进一步论证BMP-2、PDGF-BB及其二者协同在种植术后早期的促骨形成作用，以便为临床种植工作的早期、联合用药提供理论支持。

[1]廖乃顺，李钻芳，林如辉，等.比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值[J].中国组织工程研究,2014,18(33):5266.

[2]罗云纲,曲露露,李美华.骨形态发生蛋白与血小板衍生性生长因子在骨形成中协同作用的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2013,39(5):1085.

[3]Larsson CW,Thomsen P,Aronsson BO,et al.Bone Response to Surface-Modified Titanium Implants:Studies on the Early Tissue Response to Implants with Different Surface Characteristics[J].International journal of biomaterials,2013,2013(1):412482.

[4]Murray SS,Brochmann Murray EJ,Wang JC,et al.The history and histology of bone morphogenetic protein[J].Histology & Histopathology,2016,31(7):721.

[5]Kanczler JM,Oreffo RO.Osteogenesis and angiogenesis:the potential for engineering bone[J].European Cells & Materials,2008,15(1):100.