CD200表达与结直肠癌的关系研究

刘俊婷，侯睿达，安治国，毛静涛，侯治富*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.北京龙迈达斯科技开发有限公司，北京101111)

CD200属于白细胞分化抗原，是一种Ⅰ型膜糖蛋白[1]，胞膜外区有两个免疫球蛋白样结构域。CD200在人类和啮齿类动物均有表达，广泛分布于中枢神经系统神经元细胞、活化的T细胞、B细胞、滤泡树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等[1，2]。CD200的主要受体为CD200R，CD200与CD200R的相互作用可作为免疫耐受信号，影响髓细胞的活性，降低它们的迁移作用[3]。CD200R表达相对局限，主要分布于髓系来源的细胞(如树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等)及淋巴细胞[4]。近年来的研究发现CD200高表达见于结肠癌、骨髓瘤、乳腺癌、脑瘤、黑色素瘤和正常间质干细胞[5]。因此研究CD200在结肠癌的表达以及作用机制，可为结肠癌肿瘤免疫调节的研究提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验筛查了43例结肠癌病例，26例癌旁正常组织。由北京龙迈达斯科技开发有限公司制作组织芯片。组织芯直径为1.5 mm，切片厚为2 μm，组织芯数为69芯。

1.2 实验方法[6]

(1)将组织芯片切片浸泡于二甲苯中20 min，换新鲜二甲苯重复一次，进行脱蜡处理；分别配制100%酒精、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸馏水梯度溶液，将脱腊后的组织切片置于100%乙醇浸泡5 minx2次；

(2)依次置于95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸馏水中各浸泡5 min进行水化；

(3)用微波高火加热抗原修复液柠檬酸-柠檬酸钠至沸腾，然后放入切片，再用微波高火加热5 min，补充蒸馏水恢复体积后再用微波高火继续加热5 min；

(4)将芯片取出，室温条件下待其自然冷却，用新鲜配置的3%H2O2(现用现配)滴片，于室温下避光孵育10 min；

(5)用PBS洗涤5 min，以去除内源性过氧化物酶；

(6)室温条件下，用10%正常羊血清封闭10 min。

(7)加入1∶50抗CD200抗体(购于美国Abcam公司)，同时用PBS配制的10%正常羊血清作为实验阴性对照，置于4℃，过夜；

(8)然后用PBS洗涤3次，每次5 min；严格按Dakocytomation Envision + TM System HRP试剂盒的说明书的操作进行染色；

(9)染色后用苏木精复染细胞核，用中性树胶封片；

(10)光学显微镜下观察，记录结果。

1.3 结果判定

CD200的表达定位于细胞膜，阳性产物均为黄色或棕黄色颗粒。结果根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在全部组织细胞中所占比例判定：A：按细胞显色深浅记分，棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无阳性反应细胞为0分。B：按显色细胞数记分，阳性细胞数>75%为4分，阳性细胞数≥51%-75%为3分，阳性细胞数≥26%-50%为2分，阳性细胞数≥5%-25%为1分，阳性细胞数<5%为0分[6]。

1.4 统计分析

采用SPSS22.0统计软件，对实验数据进行χ2检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

通过芯片技术对样本进行免疫组化检测，其中结肠癌和癌旁正常组织的表达范围分为五个等级，强度分为四个等级。结肠癌组织芯片的免疫组化结果如表1 和表2所示。对样本CD200 表达的范围和强度进行χ2检验，统计结果表明： CD200 在结肠癌组织中的表达强度与表达范围均高于正常组织(P=0.001)。

表1 结肠癌样本CD200表达范围

表2 结肠癌样本CD200表达强度

3 讨论

大肠癌在西方国家居癌症引发死亡的第三大杀手[7]，在我国也是最常见的消化道肿瘤之一，我国发病率也呈逐年增长的趋势，因此，积极开展结肠癌的防治研究具有重大科学意义。据文献报道，CD200的表达在某些肿瘤组织(如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤等)中较高[9]，且在抑制肿瘤免疫方面具有重要作用，提示其是一个潜在的肿瘤干细胞表面标志。本文研究结果显示，CD200 在结肠癌组织中高度表达，正常结肠组织中CD200的表达强度和范围均低于结肠癌组织(P=0.001)。CD200/CD200R的相互作用可以传递免疫抑制信号，是体内免疫稳态的维持的参与者。然而，无论在实体肿瘤还是血液肿瘤中，CD200的表达均升高。有学者指出CD200 高表达可作为结肠癌患者的重要标志，CD200 分子的高表达与结肠癌的发生发展具有密切的关系。结合本次实验结果，提示 CD200 的表达在促进结肠癌的发生发展及结肠癌预后的研究中具有重要意义。

有研究指出，与CD200-结肠组织细胞相比，CD200+结肠细胞较易形成肿瘤细胞，同时，体外实验显示 CD200+结肠癌细胞有更强的侵袭性。研究者将表达CD200的肿瘤接种在NOD/SCID小鼠中，发现淋巴细胞对肿瘤的清除作用被其抑制，而加入CD200抗体后，该抑制作用被中和[5]。此外，CD200对调节性T细胞的诱导和细胞因子的产生方面有作用，因此通过阻断抑制CD200分子的作用，对高表达CD200的肿瘤的治疗具有潜在的价值。

Kawasaki BT[8]等研究发现，CD200可表达于大肠癌的干细胞中，是潜在的干细胞表面标志物和免疫抑制因子，认为大肠癌干细胞可能通过表达CD200，依赖其介导的免疫机制来逃避免疫监视，表明CD200的表达是大肠肿瘤干细胞和肿瘤免疫之间重要的桥梁。同时，肿瘤干细胞也可能以分泌多种免疫抑制因子的方式来抑制机体的免疫系统，从而在肿瘤干细胞周围形成一个免疫耐受的微环境，促使肿瘤发生复发和转移[10]。通过基因芯片分析CD44+CD133+结肠癌COLO205细胞和CD200+结肠癌细胞的表达谱发现，很多基因在两种细胞中的表达都增高[11]，均提示大肠癌干细胞可以通过CD200依赖的免疫机制抑制肿瘤免疫。因此阻断CD200的作用，对于高表达CD200的肿瘤的治疗具有重要意义。本实验验证的结肠癌组织中CD200高表达的结果表明，通过阻断CD200分子的免疫抑制作用，对结肠癌治疗具有潜在的前景。

[1]黎丽旋,肖 冰.CD200介导的大肠癌干细胞与肿瘤免疫的研究进展[J].现代消化及介入诊疗，2012，17(06):364.

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[4]任 燕.CD200/CD200R1在类风湿关节炎中的作用机制和意义[D].北京协和医学院.2012.

[5]黎丽旋.CD200与CD133+Colo205大肠癌细胞共表达及成瘤实验研究[D].南方医科大学.2013.

[6]侯睿达,安治国,刘俊婷,等.CD200和CD200R在膀胱和肾脏肿瘤表达的研究[J].中国实验诊断学，2016，20(10):1661.

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[11]Shan-Shan ZHANG,Zai-Wei HUANG,Li-xuan LI,et al.Identification of CD200+ colorectal cancer stem cells and their gene expression profile[J].ONCOLOGY REPORTS,2016,36:2252.