鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与生物信息学分析

任攀，刘情，李文文，刘亚刚

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

鸭病毒性肠炎（DVE）又名鸭瘟，鸭瘟病毒（DPV）是该病的病原，属于疱疹病毒科（为双股DNA），具有疱疹病毒的基本特征[1]。胸苷激酶（TK）基因是大部分疱疹病毒复制的非必需基因，是疱疹病毒的主要毒力基因之一。研究表明，TK基因具有疱疹病毒早期基因的典型特征[2]，其编码的胸苷激酶在胸腺嘧啶合成补救途径中是必不可少的。疱疹病毒TK基因缺失后表现出在神经细胞的复制能力明显减弱，但其免疫原性不变，因而TK基因是疱疹病毒构建缺失疫苗的首选靶基因[3]。本研究通过对鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与生物信息学分析，为进一步明确DPV TK基因的功能提供了依据。

1 材料与方法

1.1 毒株和质粒 DPV AV 1221株购于中国兽医药品监察所，DPV鸡胚化弱毒疫苗株购于广西丽原生物股份有限公司，PMD-19T Vector购于天根生化科技有限公司。

1.2 主要试剂 DNA纯化回收试剂盒、质粒小提取试剂盒、感受态细胞JM109均购于天根生化科技有限公司，Phusion High-Fidelity PCR Kit购于 New England Biolabs公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank上收录的DPV基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计出特异性引物（由擎科生物公司合成），用于DPV TK基因的扩增。引物序列F1为5′-CGCGGATCCTCAC TGCGCGACTCTTGCGA，R1 为 5′-CCCAAGCTTATTA ATTGTCATCTCGGTAT。

1.4 病毒DNA提取 按照酚-氯仿-异戊醇法提取DNA，提取的DPV DNA置于-20℃保存。

1.5 TK基因的PCR扩增 以提取的DNA为模板，根据设计的特异性引物进行PCR扩增，反应体系如下：DNA 模板 2.5 μL，1μM 上下游引物各 2.5μL，5×Phusion Buffer 10 μL，10 μM dNTPs 1 μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31 μL。PCR 反应条件：98℃预变性 30 s；95℃变性 10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸35s，共30个循环；最后72℃延伸8 min，16℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，用DNA纯化回收试剂盒进行回收。

1.6 TK基因的克隆及鉴定 将回收TK基因的PCR产物与载体PMD-19T连接，构建重组克隆载体，并转化至感受态细胞JM 109，再接种于含X-gal、Amp（50mg/μL）和 IPTG 的平板上，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落接种于含Amp（50 mg/μL）的LB液体培养基中，37℃扩大培养。菌液PCR鉴定：根据质粒小提取试剂盒说明书提取质粒，重组质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。

1.7 TK基因的序列测定及生物信息学分析 将阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，同时对TK基因的核苷酸序列及其所推测氨基酸序列进行生物信息学分析。

1.8 TK基因序列的相似性分析 对本次所测的2株鸭瘟病毒TK基因序列进行BLAST分析，然后从GeneBank上下载鸭瘟病毒不同分离株的TK基因序列，然后通过Megalign程序进行相似性分析。

2 结果与分析

2.1 DPV强、弱毒株TK基因扩增 结果见图1。图中在约1077bp处出现特异性条带，与预期大小符合，说明扩增成功。

图1DPV的PCR检测结果

2.2 DPV TK基因重组质粒鉴定 经PCR验证为阳性的重组质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，在约1077bp及2651bp位置处出现特异性条带，与预期结果一致（图2），表明重组克隆质粒构建成功。

2.3 DPV TK基因的生物信息学分析

2.3.1 DPV强、弱毒株TK基因同源性分析 将测序得到的两组序列用BioXM软件进行对比分析，得出两片段的同源性高达100%。

2.3.2 胸苷激酶理化性质分析 预测胸苷激酶由358个氨基酸组成，理论等电点pI为6.03。

2.3.3 蛋白亲水性分析 胸苷激酶的疏水性分析结果显示：胸苷激酶为亲水性蛋白，但该蛋白N端（158～162aa）有一明显的高疏水区域。

图2 TK基因重组质粒的鉴定结果

2.3.4 DPV胸苷激酶的二级结构及跨膜分析 分析结果显示，胸苷激酶中α螺旋占50.28%，延伸链占11.45%，无规则卷曲占38.27%。根据Burhard理论推断出该蛋白属于混合型蛋白。胸苷激酶的跨膜区预测结果显示，胸苷激酶的全部氨基酸均位于细胞膜外部。

2.3.5 信号肽预测 胸苷激酶的信号肽预测显示，氨基酸的信号肽分值（S-score）均低于阈值，可以判定胸苷激酶中没有信号肽成分，不是分泌蛋白。

2.3.6 DPV胸苷激酶的抗原表位和B淋巴细胞抗原结合表位分析 抗原表位分析结果显示，胸苷激酶的平均抗原趋向性为1.0277，共包含有14个可能的抗原表位，其中第11位至第30位氨基酸形成的抗原表位“IRRAFSVPSMPLCLVRVYLD”具有最高的抗原指数。使用Bcepred在线工具预测胸苷激酶的B淋巴细胞抗原结合表位，结果共发现7个B细胞结合表位，见图3。

图3 DPV胸苷激酶的B细胞表位预测

2.3.7 TK基因序列的相似性分析 本研究中2株鸭瘟病毒的TK基因之间的相似性为100%，与GeneBank上TK基因序列的最高相似性为99.8%～100%。

3 小结与分析

本研究对DPV强、弱毒株的TK基因进行了克隆、测序，得出两片段的同源性高达100%，通过与其他不同来源的鸭瘟病毒株进行比对，发现其同源性也达到了99.8%～100%，说明TK基因具有高度保守性。而樊振华等[4]、Kit等[5]敲除病毒的TK基因，可使毒株毒力下降，说明TK基因对病毒毒力的影响很大。鸭瘟病毒TK基因的高度保守性，意味着利用TK蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法难以用来区分野毒感染与疫苗感染，并且TK基因不是导致鸭瘟强、弱毒株致病性差异的主要因素[6]。

生物信息学是生物学领域发展最为快速的学科，具有高效、可预见性和综合性强的优点[7]。本试验通过对TK蛋白进行生物信息学分析，结果显示：TK蛋白为亲水性，但其中所含高疏水性区域的氨基酸主要用于稳定蛋白质的三维结构，猜测与胸苷激酶活性有关[8]；通过Burhard理论推断TK蛋白的二级结构，认为该蛋白属于混合型蛋白；跨膜区预测表明，DPV TK蛋白是膜外蛋白，说明TK蛋白不介导DPV对宿主细胞的吸附和转染，同时也从侧面证明了TK基因是DPV复制的非必需基因；信号肽预测得出该蛋白没有信号肽成分，不是分泌蛋白；抗原表位分析显示，TK蛋白具有最高的抗原指数；使用Bcepred在线工具预测胸苷激酶的B淋巴细胞抗原结合表位，共发现7个B细胞结合表位，表明TK蛋白拥有较高的抗原性。

本研究通过预测TK蛋白的性质和功能，为蛋白的表达及抗原性鉴定提供了理论支持。

[1]Plummer P J，Alefantis T，Kaplan S，et al.Detection of duck enteritis virus by polymerase chain reaction[J].Avian Disease，1998，42（3）：554-564.

[2]Gale M J，Tan S L，Katze M G.Translational control of viral gene expression in eukaryotes[J].Microbiology and Molecular Biology Review，2000，64（2）：239-280.

[3]葛菡，程安春，汪铭书，等.疱疹病毒TK基因的研究进展[J].中国兽医科学，2008，38（1）：86-90.

[4]樊振华，孟帆，吴忻，等.猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析[J].中国畜牧兽医，2014，41（4）：12-17.

[5]Kit S.Thymidine kinase[J].Microbiological Science，1985，12（2）：369-375.

[6]李昌主，韩先杰，邹玲，等.鸭瘟病毒AV 1221 TK基因的克隆与序列分析[J].青岛农业大学学报，2007，24（3）：162-164.

[7]宋得华，潘华奇，黎应胜，等.鸭瘟病毒TK基因及其编码蛋白的生物信息学分析[J].安徽农业科学，2007，35（31）：9935-9936.

[8]葛菡，徐超，程安春，等.鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析[J].中国兽医科学，2008，38（4）：297-302.