1株阳离子蓝染料高效脱色菌的分离鉴定及特性研究

张 璐，张崇淼*，牟 霄，张琪雯

(1.西安建筑科技大学 环境与市政工程学院 西北水资源与环境生态教育部重点实验室 陕西省环境工程重点实验室，陕西 西安 710055；2.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065)

阳离子染料又称碱性染料或盐基性染料，主要用于腈纶纤维的染色。根据染料分子中阳离子电荷与发色团共轭体的组成形式，可将其划分为隔离型和共轭型两大类[1]，绝大多数阳离子染料属于后者。阳离子蓝是共轭型阳离子染料的典型代表，具有着色力强、耐晒牢度高等优点，其发色团共轭体中有偶氮键、芳环和含氮杂环[2]。我国是阳离子染料生产和使用的主要国家，每年产量占染料生产总量的20%～30%。阳离子染料在生产和使用过程中容易流失[3]，废水的色度高达几万至几十万，可生化性差[4]，给环境治理带来严重威胁。目前用于处理阳离子蓝染料废水的方法包括吸附法[5-6]、氧化法[7-9]和电化学法[10-11]等，但大都存在处理成本高、易造成二次污染的缺点。采用生物处理技术可以有效地解决上述问题，但由于阳离子染料难生化降解的特性，故常需要使用特定的功能菌才能实现良好的处理效果。近年来的研究发现了对阳离子染料具有良好脱色效果的微生物，例如假单胞菌(Pseudomonas)[12-13]、库特氏菌(Kurthia)[14]、棒状杆菌(Coryneforms)[15]等，但它们对脱色条件要求较严格，达到良好脱色效果所需时间较长，对染料浓度的耐受能力十分有限，这在很大程度上限制了其推广应用。因此，寻找适应性强、对阳离子染料具有快速高效脱色性能的微生物，进一步开发阳离子染料生物处理技术具有重要的意义。阳离子蓝是一种色泽浓艳的偶氮类水溶性染料，在腈纶的染色和印花中使用量非常大，但目前鲜有阳离子蓝染料脱色菌的报道。本研究针对阳离子蓝染料筛选分离脱色菌，利用16S rDNA分析比对法进行种属鉴定。通过在不同条件下的脱色试验研究该菌株的脱色特性和影响因素，并对其连续脱色性能进行考察，以期为该脱色菌的工业化应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 染料 选用的染料为阳离子蓝SD-GSL，购自苏州市东吴染料有限公司。染料的阳离子是含有偶氮基的发色基因，其化学式为C19H23N4SO，结构式如图1所示，相对分子质量为355，在水溶液中的最大吸收波长587 nm。

图1 阳离子蓝SD-GSL的阳离子结构式Fig.1 Structural formula of cation of cationic Blue SD-GSL

1.1.2 培养基 富集培养基：牛肉膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化钠 5.0 g/L，pH调整至7.0±0.2；驯化培养基：在富集培养基中加入不同浓度的阳离子蓝SD-GSL；阳离子蓝培养基：在富集培养基中加入阳离子蓝SD-GSL，终浓度为300 mg/L；阳离子蓝平板培养基：阳离子蓝染料培养基中加入琼脂，质量分数为1.5%。

1.2 方法

1.2.1 阳离子蓝脱色菌的筛选与分离 取长期受到工业污染的土壤10 g，置于盛有90 mL无菌水的锥形瓶内，室温120 r/min振荡2 h，将悬浊液静置30 min，使颗粒物沉淀。取10 mL上清液与90 mL富集培养基混合，37 ℃ 150 r/min振荡培养12 h。取培养液10 mL转入含100 mL驯化培养基的锥形瓶中，进行阳离子蓝浓度压力驯化培养，阳离子蓝浓度范围为50～400 mg/L，递增梯度为50 mg/L。最终驯化培养获得的菌液转至富集培养基中培养12 h，然后在阳离子蓝培养平板上划线分离，挑取单菌落保存备用。

1.2.2 菌种鉴定 挑取平板上的菌落至无菌水中，置于95 ℃金属浴5～10 min后，离心取含有菌株DNA的上清液作为模板。使用16S rDNA通用引物(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3′)进行聚合酶链反应。PCR反应体系(50 μL)：无菌水34 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，MgCl23 μL(25 mmol/L)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，TaqDNA聚合酶1 μL(2.5 U/μL)，模板1 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min(30个循环)；72 ℃ 7 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳初步确定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序在GenBank数据库中对测序结果进行同源性比对分析。

1.2.3 脱色菌生长曲线的绘制 取富集培养的菌液，以富集培养基为参比，在波长600 nm处每隔 2 h测定OD600，以培养时间为横坐标，菌液的OD600值为纵坐标绘制菌株的生长曲线。

1.2.4 脱色实验和脱色率测定 取10 mL富集培养的菌液接种于90 mL阳离子蓝培养基中，振荡培养(37 ℃，150 r/min)进行脱色实验，每隔一段时间测定脱色率。脱色率测定方法：将脱色后的试样离心(10 000 r/min，10 min)取上清液，以富集培养基为参比，在587 nm处测定吸光度A1。以未加菌液的含相同阳离子蓝染料浓度的培养基作为空白，测定吸光度A0。按照下式计算菌株对阳离子蓝的脱色率。

使用终浓度为300 mg/L的阳离子蓝培养基进行脱色实验，每隔2 h测定脱色率，以培养时间为横坐标，脱色率为纵坐标绘制脱色曲线。调整培养基初始pH、温度、转速，脱色24 h后取样测定脱色率，考察这些因素对菌株脱色性能的影响，每组3次平行。

1.2.5 连续脱色实验 取10 mL菌液接种于90 mL 300 mg/L阳离子蓝培养基中，在pH、温度、转速均为最佳条件下进行连续脱色，每隔12 h测定吸光度，计算脱色率。根据脱色液中剩余阳离子蓝染料浓度在试样中补充阳离子蓝至终浓度300 mg/L，再开始下一次脱色实验。连续进行5次脱色实验，比较脱色率的变化，每组3次平行。

1.2.6 脱色途径实验 将富集培养12 h后的菌液分为2份，一份直接接种于阳离子蓝培养基中进行脱色实验，另一份则先高压蒸汽灭菌20 min后再进行脱色实验，每隔12 h测定脱色率。分别在脱色 0、6、12、24、48 h取上清液，离心后在波长200～800 nm范围内扫描吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 脱色菌株的鉴定

经筛选分离后获得1株对阳离子蓝具有高效脱色能力的细菌，命名为ZHT-3。对菌株ZHT-3的16S rDNA 进行PCR扩增后测序，获得402 bp的核酸片段。经比对分析，该核酸片段序列与蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)16S rDNA同源，一致性(identity)高达99%(表1)。结合该菌的菌落形态特征，初步判定菌株ZHT-3为蜡状芽胞杆菌，获得序列号MG738794。

表1 菌株ZHT-3的16S rDNA部分序列与GenBank中其他序列的同源性比对Table 1 Homology comparison of 16S rDNA partial sequence of strain ZHT-3with other sequences located in GenBank

2.2 菌株ZHT-3的生长曲线和脱色曲线

菌株ZHT-3在阳离子蓝培养基中测得的脱色曲线与在富集培养基中测得的生长曲线的变化趋势基本一致(图2)。在不含阳离子蓝的富集培养基中，菌株ZHT-3没有明显的迟缓期，对数生长期大约持续到8 h，然后进入稳定生长期，菌液的OD600在30 h达到峰值，而在8 h即达到峰值的86.6%。王震文[16]从纺织废水中筛选得到用来降解偶氮染料的芽胞杆菌ACT1在24 h时就进入衰亡期，相比之下ZHT-3世代时间长，有利于稳定脱色。在初始浓度300 mg/L阳离子蓝培养基中，菌株ZHT-3在8 h内脱色率急剧增加，8 h即达到76.3%。由此可见，菌株ZHT-3对阳离子蓝的脱色主要是在对数生长阶段完成的，此时菌体

图2 菌株ZHT-3的脱色曲线和生长曲线

具有较高的脱色活性，其结果与高效脱色偶氮染料活性黑5的混合菌群FF[17]有类似的作用规律，这一特性意味着该菌株可以实现对阳离子蓝的快速脱色。8 h后随着菌体的生长，脱色率逐渐增高，在30 h达到了最高脱色率98.8%。由图2还可以看出，阳离子蓝的脱色率在菌体进入稳定期后增长很缓慢，可能由于染料的中间代谢产物对菌体产生毒性，从而抑制菌株脱色。

2.3 菌株ZHT-3对阳离子蓝的脱色性能

菌株ZHT-3在不同初始染料浓度的培养基中对阳离子蓝的脱色率随时间的变化情况如图3所示。当阳离子蓝初始浓度在500 mg/L以内时，菌株ZHT-3都能够达到95%以上的脱色率，且能够长时间保持，但达到时间会随着初始浓度的升高而延长。例如对于100 mg/L初始浓度的阳离子蓝，菌株ZHT-3在12 h就达到96.7%；而对于500 mg/L初始浓度的阳离子蓝，则需要36 h才能达到95.4%的脱色率。当阳离子蓝初始浓度升至600 mg/L时，菌株ZHT-3最大脱色率为70.6%。可以看出菌株对染料的脱色率随着染料初始浓度的增加而降低，且达到最高脱色率的时间也随之延迟，推测可能是随着阳离子蓝初始浓度的升高，染料的生物毒性越强，对菌体生长以及产生偶氮还原酶活性的抑制作用也逐渐增强，导致脱色能力的明显下降。Hadi等[13]分离得到的铜绿假单胞菌对200 mg/L以上浓度范围内的甲基蓝24 h脱色率最高为43.08%。林丽英[14]筛选出对阳离子翠蓝具有脱色能力的库特氏菌108#在125 mg/L下24 h脱色率仅为49.27%。与这些研究结果进行对比可以发现，菌株ZHT-3对高浓度阳离子蓝染料的脱色性能明显优于以往报道的脱色菌。

图3 菌株ZHT-3对不同初始浓度阳离子蓝的脱色率Fig.3 Decolorization rate of strain ZHT-3 in different initial Cationic Blue SD-GSL concentration

微生物的连续脱色能力是其能否应用到实际废水处理的重要指标。随着脱色时间和次数的延长，代谢产物和有毒物质逐渐积累，在反应液的单位体积内的浓度越来越高，导致微生物脱色性能的下降。菌株ZHT-3对阳离子蓝连续脱色实验中脱色率的变化(图4)基本呈现出这一趋势，但在前两次连续脱色实验中脱色率还有所升高，达到95.4%，之后才逐渐降低。连续脱色3次，脱色率仍保持在79.2%。这说明菌株ZHT-3对阳离子蓝有较为持久的脱色性能，有利于实际应用。

图4 菌株ZHT-3对阳离子蓝连续脱色实验的脱色率Fig.4 Continuous repeated batch decolorization of Cationic Blue SD-SL by the strain ZHT-3

2.4 不同因素对脱色率的影响

废水中的pH值对生物处理十分重要，氢离子能影响细菌的生长和功能酶的活性，从而导致染料降解效果的不同。研究不同初始pH值对菌株ZHT-3脱色的影响曲线如图5A所示。可以看出菌株ZHT-3对pH的适应范围较宽，在pH 5～8范围内24 h脱色率均在93.4%以上，其中在pH 为7时脱色率最高，可达98.4%，可能是由蜡状芽胞杆菌生长的最适pH是中性条件决定的。当pH大于8或者小于5时，脱色率急剧下降。说明pH值过高或过低影响酶功能及其催化反应速率，严重抑制菌株的脱色。

不同温度下菌株ZHT-3的脱色情况如图5B所示。培养24 h后，该菌能够在30～40 ℃范围内保持较高的脱色率，表明菌体产生的偶氮还原酶在这一温度范围内均具有较高的酶活性。而当温度超过40 ℃时脱色率急速降低至18.6%，其原因可能由于菌体蛋白质、核酸、酶等重要组成成分因温度过高发生不同程度的破坏，影响菌株的脱色能力[16]。而当温度低于30 ℃时菌株的脱色能力逐渐降低，25 ℃时脱色率为52.4%，可能是由于温度过低抑制了菌体生长繁殖，降低酶活性，导致脱色率的下降。

转速在150 r/min时，菌株ZHT-3对阳离子蓝的脱色率最高，达98.5%。转速在0～200 r/min范围内，脱色率可保持在92.1%以上，可见振荡转速对菌株ZHT-3的脱色并没有明显影响(图5C)。因此在实际应用中，可以选择静置脱色，降低成本。脱色后培养基内溶解氧含量较脱色前明显减少，这说明菌株ZHT-3在降解阳离子蓝时需要氧的参与。

图5 不同pH(A)、温度(B)和转速(C)对脱色率的影响Fig.5 Influences of different pH(A)、temperature(B) and shaking speed(C) on decolorization rate

2.5 ZHT-3对阳离子蓝的脱色途径

从图6可以看出，使用活菌ZHT-3对阳离子蓝的脱色率明显高于使用高压蒸汽灭活后的菌株，前者的脱色率可达95%以上，而后者却仅约13%。使用灭活后菌株进行脱色实验后，反应液经离心回收的沉淀呈深蓝色，而用未灭活菌株则无此现象。说明灭活后菌株仅通过吸附作用去除阳离子蓝，其脱色效果十分有限。因此菌株ZHT-3对阳离子蓝的生物降解在脱色过程中发挥了主要作用。

对比观察脱色过程中试样上清液的紫外-可见吸收光谱，可以发现脱色前的试样在587 nm处有阳离子蓝的特征吸收峰。随着脱色反应的进行，该特征吸收峰的强度不断减弱。脱色24 h后，则完全消失(图7)。这表明阳离子蓝的偶氮键发生断裂，生色团消失。此外，该特征吸收峰在强度降低的过程中吸收波长发生红移，这是由于偶氮共轭体系被破坏后，连接在偶氮键两侧的取代基发生了变化。

表2 不同阳离子染料脱色菌的脱色性能Table 2 ecolorization performance of different decolorizing bacteria for Cationic Dye

图6 活菌与灭活菌对阳离子蓝的脱色率Fig.6 Decolorization rate of Cationic Blue SD-GSL by live and dead strain ZHT-3

图7 阳离子蓝脱色过程中的吸收光谱Fig.7 Absorption spectrum during the decolorization process ofCationic Blue SD-GSL

3 讨 论

目前，有关阳离子染料生物脱色研究主要针对的染料包括碱性蓝41、甲基蓝、阳离子翠蓝X-GB等。表2列举了现有脱色菌的种类及其脱色性能。尽管它们最佳脱色率都很高，但在对染料初始脱色浓度、达到最佳脱色率所需时间上存在明显差别。

与以往报道的阳离子染料脱色菌相比，本研究分离得到的蜡状芽胞杆菌ZHT-3不仅脱色率高，而且能够适应阳离子染料更高的初始浓度，并能够在更短的时间内达到最佳脱色率。这些特点意味着该菌在未来的实际应用方面具有突出的优势。

值得注意的是，Telke等[21]以活性染料活性橙16为目标染料驯化得到波株芽胞杆菌ADR(Bacillussp.)，发现该菌株对阳离子染料碱性绿4也具有一定的脱色能力，对100 mg/L碱性绿4在60 h脱色率为94%，但并未鉴定出该芽胞杆菌的具体菌种。芽胞杆菌属包括枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞菌、蜡状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等，共计147种[22]。不同种类的芽胞杆菌特性差异很大，并非所有的芽胞杆菌都具有降解阳离子染料的能力。目前蜡状芽胞杆菌在降解环境污染物中的研究较多，如四环素、有机磷农药和芘污染物等[23-25]。但就作者所知，尚未见有关蜡状芽胞杆菌对阳离子蓝染料脱色的研究报道。

本研究筛选出的蜡状芽胞杆菌ZHT-3能够对阳离子蓝快速脱色，在脱色12 h后对300 mg/L阳离子蓝的脱色率达84.5%。随后脱色率缓慢增加，直至在30 h达到最大脱色率98.8%。沈明等[26]提出，阳离子染料含有很复杂的芳香基团，其偶氮双键还原为胺基而脱色产生的胺基类中间产物毒性比较大，对菌株生长有抑制作用，这可能是造成脱色后期脱色率增长缓慢的主要原因。

研究菌株ZHT-3降解特性时发现，对于500 mg/L以内的高浓度染料有非常好的脱色效果及耐受能力。随着初始阳离子蓝浓度的增加，对菌体生长的抑制作用更明显，菌株的脱色速率逐渐有所降低，虽然高浓度的脱色速率比低浓度的脱色速率低，但到后期脱色稳定后基本持平。如若对菌株在高浓度下进行长期驯化，很可能继续提高菌株的耐受能力及脱色性能，更有利于其作为工程菌使用，为降解阳离子染料废水高浓度有机污染物提供有用的菌源。阳离子染料废水pH低，菌株ZHT-3在pH 5～8，30～40 ℃范围内都有良好的脱色性能。Kale等[12]利用碱性蓝41筛选出的假单胞菌AAB3在pH 6～ 7，37 ℃时脱色率达到80%。李玲玉等[15]筛选出的棒杆菌51#在pH为 7，30 ℃下脱色率最高为61.6%，对脱色条件要求严格。与上述菌株相比，ZHT-3对环境的适应能力更好。同时ZHT-3在静置或振荡条件下脱色率均在92.1%以上。弥补了以往菌株脱色所需时间较长、脱色条件单一、脱色浓度过低等方面的局限。

关于连续脱色对微生物脱色性能的影响研究很少。在实际废水处理中，随着脱色反应的进行，由于源源不断的污染物负荷以及有毒物质产生等均会导致微生物脱色性能的下降，使得微生物在染料废水生物处理中存在很大的局限性。本研究中菌株ZHT-3 连续脱色2次后的脱色率由85.8%上升至95.4%，这是由于菌株ZHT-3无法以染料作为唯一碳源并加以利用，只能通过外加碳源为菌体生长提供所需能量和电子供体，从而合成偶氮还原酶使染料降解脱色。在初次脱色时碳源充足，其代谢调控被碳源所抑制，降低合成偶氮还原酶的能力，而第二次脱色时碳源处于低水平浓度，在该条件下更有利于酶的合成，促进菌株的脱色[27]。菌株ZHT-3连续脱色3次其脱色率仍保持在79.2%，而王震文[16]通过紫外诱变得到的菌株YZU1每隔24 h 接入100 mg/L的活性黑5进行连续脱色2次后，脱色率已降至58%。尹亮[28]利用混合菌群共培养对100 mg/L的直接蓝289连续脱色3次脱色率为76.4%。由此可见，菌株ZHT-3的连续持久脱色能力明显优于已报道的单一菌株和混合菌群，培养条件相对简单，有利于工业应用。

菌株ZHT-3主要通过生物降解作用实现对阳离子蓝的脱色，能够使阳离子蓝的偶氮键断裂，从而破坏阳离子蓝的生色团，达到脱色效果。有关阳离子蓝脱色产物的结构及毒性、降解机制有待进一步研究，以期为染料废水处理提供科学参考。