加工番茄小孢子细胞学发育时期与花器形态相关性研究

单淑玲，庞胜群，郭晓珊，张国儒

(石河子大学农学院园艺系/特色果蔬生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】番茄(LycopersiconesculentumMill.)是茄科番茄属一年生或多年生草本植物，根据其用途分为加工番茄和鲜食番茄两类。世界第一大番茄制品出口国是中国，美国加州、中国新疆与地中海并列为世界三大番茄酱产区[1]。番茄属于自花授粉植物，番茄花由花梗、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊组成，两性花，聚伞花序，小果型品种多为总状花序。影响单倍体育种成败的关键因素之一是小孢子所处的发育时期[2]，研究小孢子发育时期与花器形态的相关性对单倍体育种有非常重要的意义。【前人研究进展】对园艺植物中红枣[3]、辣椒[4]、青花菜[5]、火龙果[6]、萝卜[7]和甘蓝[8]等小孢子细胞学与花器形态相关性研究已有报道。【本研究切入点】目前，加工番茄常采用的育种方法为杂交育种，杂交育种获得新品种(系)的周期较长。常见缩短育种周期，快速获得植物新品种(系)的有效方法是植物单倍体育种。植物单倍体育种以花药作为外植体利用花药离体培养或游离小孢子培养技术将花药培养成单倍体植株，将单倍体植株加倍成纯合二倍体的育种方法。研究小孢子发育时期及花器官形态。【拟解决的关键问题】以加工番茄3个杂交种为材料，研究小孢子不同发育时期的花器形态与细胞学形态。确定小孢子不同发育时期的花器官形态，为加工番茄花药培养提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

以加工番茄的3个杂交品种(P1×20040805、20040805×钻石和P3×20040805文中分别用字母C1,C2和C3代替)为材料，试验材料由石河子大学农学院园艺系蔬菜课题组提供。2017年8月将番茄种子催芽(温汤浸种)后播种于50穴盘中，基质为草炭和蛭石按体积比为1∶1进行配置。待幼苗第四片真叶完全展开大概为35～40 d时，选取生长状态一致的番茄幼苗定植于石河子大学农学院试验站温室。正常田间管理至番茄植株盛花期开始采样。

1.2 方 法

1.2.1 花蕾和花药形态观察与测量

于晴天08:00～10:00(采蕾环境温度范围为15～18℃)，采摘加工番茄健壮植株上的花蕾装入自封袋内做好标记并放入冰盒内快速带回实验室。将采摘的花蕾随机抽取并用游标卡尺测量花蕾长度,每个品种按照花蕾长度,分为六个长度区间等级(3.00～3.99 mm；4.00～4.99 mm；5.00～5.99 mm；6.00～6.99 mm；7.00～7.99 mm和8.00及8.00 mm以上)，然后在解剖镜下用镊子剥去萼片、花瓣，取出花药，观察其颜色和形态特征。

1.2.2 花蕾细胞学观察

将采摘好的花药先用卡诺固定液(无水乙醇和冰醋酸体积比为3∶1)进行处理，在室温下固定24 h后，取出花蕾放入小烧杯，用蒸馏水冲洗2～3次，置于70%乙醇中，放在4℃冰箱中备用。镜检时将处理好的花蕾，用镊子剥去萼片、花瓣，取出花药。先滴一滴醋酸洋红染液在载玻片上，然后取2枚花药放在染液上用镊子挤碎花药，并将多余的花药壁等杂质夹出来。盖上盖玻片，将多余的醋酸洋红染液用滤纸吸出。在数码荧光倒置显微镜(Axio Observer.A1)下观察，每个长度等级在显微镜下观察100个不同视野，记录每个视野中花粉细胞总数及单核靠边期个数，并拍摄小孢子不同发育时期的照片。

1.3 数据处理

试验数据采用用SPSS 18.0软件进行处理，图片采用IMAGE J软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 小孢子发育时期花器形态学特征

三个加工番茄品种均为聚伞花序，在种植过程中观察发现，C1和C3始花期一致，而C2始花期较前者晚3 d，但不同品种加工番茄小孢子各发育时期对应花器官外部形态特征基本相同。研究表明，花蕾和花药发育进程在花蕾大小，萼片颜色及花蕾闭合程度，花药在颜色方面及剥离程度的变化。花蕾长度在3.00～4.99 mm时花蕾较小、闭合严密、萼片呈绿色；花药为绿色难剥离；花蕾长度在5.00～6.99 mm时花蕾膨大、微微张开、萼片黄绿色；花药为黄绿色易剥离 ；花蕾长度在7.00～8.00 mm以上时花蕾明显膨大、张开、萼片黄色，花药为黄色易剥离。图1

2.2 小孢子发育时期的细胞学特征

研究表明，四分体时期是小孢子母细胞经过减数分裂产生，小孢子母细胞被一层厚厚的胼胝质包围染色体解旋后形成四个核，然后四个核之间同时发生胞质分裂，分裂成由胼胝质壁包围的四分孢子，即四分体。单核早、中期的花粉小孢子细胞体积变大，小孢子细胞中心有一个较大的细胞核，细胞有明显的细胞壁且细胞质中未发现液泡。随后花粉细胞体积持续增加，细胞呈正圆形，细胞核靠近细胞壁和显现萌发孔，即单核靠边期。单核靠边期的后期进行有丝分裂，通过有丝分裂产生两个细胞核，体积大的为营养核，靠近液泡；体积小的为生殖核，贴近花粉壁。图2

注：图1-A、1-B、1-C为3个品种花蕾外部形态图；图1-D、1-E、1-F从相对应的上排花蕾中解剖的花药外部形态图。(标尺=50 um)

Note: Figure 1-A, 1-B, 1-C are external morphological maps of three varieties of buds; Figure 1-D, 1-E, 1-F are external anatomical figures of anthers dissected from corresponding upper row buds. (Scale=50 um)

图1 3个杂交组合加工番茄小孢子各发育时期花蕾和花药外部形态
Fig.1 Processing tomato of buds and anther external morphology of tomato microspores in three hybrid combinations

注：A.四分体时期(40×10)；B. 单核早、中期 (40×10)；C.单核靠边期(40×10)；D.双核期(40×10)(标尺=20 um)

Note:A． Tetrad; B． Early and mid - uninucleate; C．uninucleate; D． Binucleate

图2 加工番茄花粉小孢子各发育时期的细胞学特征
Fig.2 Cytological characteristics of pollen microspores at various developmental stages in processing tomato

2.3 花蕾长度与花粉小孢子单核靠边期的关系

加工番茄杂交组合，不同花蕾长度不同的花粉小孢子单核靠边期比例存在显著性差异。C2和 C3这2个番茄品种的花蕾长度在5.00～5.99 mm 时与其它5个长度区组之间差异显著，在该长度范围内，2个加工番茄品种的单核靠边期的小孢子所占比例分别为61.88% 和53.75%。C1品种的花蕾长度在6.00～6.99 mm 时与其它5个长度区组之间差异显著，在该长度范围内，单核靠边期的小孢子所占比例为61.59% 。该番茄品种的花蕾长度在 3.00～3.99 mm与7.00～7.99 mm 和8.00及8.00 mm以上时，花粉小孢子的单核靠边期比例在4%到10%之间，花粉小孢子单核靠边期比例差异不显著。但是当花蕾长为3.00～3.99 mm和8.00及8.00 mm以上时，此3个番茄品种的单核靠边期比例基本都小于10%。杂交组合C1花蕾长度在6.00～6.99 mm 时，C2和C3花蕾长度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子的单核靠边期比例最高，可以将花蕾长度作为番茄花药培养试验研究中的采样指标之一。表1

表1 不同花蕾长度区组的加工番茄花粉小孢子单核靠边期比例
Table 1 Percentages of uninucleate microspores in anthers of Processing tomato at different developmental stages

花蕾长度Flower buds (mm)单核靠边期比例 Percentages of uninucleate microspores (%)C1C2C33.00～3.993.21 ±0.10Dd6.62 ±0.20Cc10.83±0.26Dd4.00～4.9917.41±0.33Cc30.71±0.37Bb20.37±0.35Cc5.00～5.9943.27±0.40Bb61.88±0.33Aa53.75±0.39Aa6.00～6.9961.59±0.32Aa27.70±0.33Bb36.24±0.38Bb7.00～7.9910.71±0.25CDcd14.68±0.24Cc22.45±0.32Cc8.00及8.00以上4.54±0.18Dd5.80±0.18Cc7.32±0.19Dd

注: 不同小写字母表示在 0.05水平下差异显著，不同大写字母表示在0.01水平下差异显著

Note: Different lowercase letters expressed significant difference at the 0.05 level，different capital letters expressed significant difference at the 0.01 level

3 讨 论

3.1 小孢子发育时期与花器形态的相关性

加工番茄小孢子的发育阶段与花器各项形态指标具有相关性，不同品种加工番茄相同小孢子发育时期所对应的花器外部形态存在一定的差异。前人研究发现[9-11]，当花药为绿色且花药末端略带淡紫色时，小孢子的发育时期在单核期与双核早期之间，处于第一次有丝分裂时期，小孢子比较有可能向单倍体方向发育。研究发现当小孢子处于单核靠边期时，花蕾和花药的形态特征是：花蕾膨大、微微张开、萼片黄绿色，花药颜色为黄绿色易剥离。

3.2 小孢子发育时期的细胞学特征

试验小孢子发育时期的观察采用醋酸洋红染色法，通过在显微镜下观察花粉小孢子的发育情况，对小孢子不同发育时期的细胞学特征进行研究。通过显微镜观察，发现加工番茄小孢子发育时期大致分为四个时期。每个时期可以根据细胞核的数量，位置以及其他明显特征进行简单的区分。此外，彭真、张永华等均研究发现[12-13]，四分体时期是小孢子母细胞分裂成由胼胝质壁包围的四分孢子，即四分体时期；单核早、中期的花粉小孢子细胞中心有一个较大的细胞核，细胞有明显的细胞壁且细胞质中未发现液泡细胞呈正圆形；细胞核靠近细胞壁和显现萌发孔，即单核靠边期；双核期产生两个细胞核，体积大的为营养核，靠近液泡，体积小的为生殖核，贴近花粉壁。

3.3 花蕾长度与花粉小孢子单核靠边期的关系

利用花药培养技术可获得单倍体或纯合二倍体植株，可缩短育种年限，但是不是任何发育时期的花粉小孢子在培养基培养时能诱导产生胚状体或愈伤组织。只有发育到特定的时期，加工番茄小孢子较适宜的时期为单核靠边期。此外，在园艺植物甘蓝中发现，花蕾长度在 4.5～5.49 mm 时，小孢子多数处于单核靠边期，较容易诱导出胚状体[14]。江伟等[15]在大白菜游离小孢子培养中得出，当花蕾长度在 2.0～2.5 mm，单核靠边期比例高，产胚量最高。就多数植物而言,单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。一般认为花蕾的长度、瓣药比是判断小孢子发育阶段的可靠指标[16]。试验通过镜检发现杂交组合C1花蕾长度在 6.00～6.99 mm 时，C2和 C3花蕾长度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多数处于单核靠边期，因此，可以将花蕾长度作为加工番茄取材时期的参考指标。

4 结 论

不同品种加工番茄相同小孢子发育时期所对应的花器外部形态存在一定的差异。杂交组合C1花蕾长度在 6.00～6.99 mm 时，C2和 C3花蕾长度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多数处于单核靠边期。此时花蕾外观和花药的形态特征是：花蕾膨大、微微张开、萼片黄绿色，花药颜色为黄绿色易剥离。影响花药培养的因素之一是花粉发育时期，花粉发育时期与花蕾或花药形态密切相关，对于花药离体培养来说不是任何发育时期的小孢子都合适。前人对小孢子发育时期的研究认为[17-20]，小孢子处于单核后期时，花药培养比较容易成功。此外，在大规模的植物组培生产过程中，利用显微镜观察每一个花蕾所处小孢子发育时期是不可能的。在进行加工番茄单倍体育种时，可以根据此时期的特点，通过测量加工番茄花蕾长度，鉴定小孢子的发育时期。

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