二甲双胍联合紫杉醇诱导人乳腺癌细胞MCF—7凋亡的作用机制研究

梁君伟 方志华 李青山 吕喜英

[摘要] 目的 探討二甲双胍联合紫杉醇诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的作用机制。 方法 以CCK-8试剂盒检测不同浓度二甲双胍（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）、紫杉醇（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 μmol/L）单独作用或联合作用MCF-7细胞48 h后对细胞增殖的半抑制浓度（IC50）值;以流式细胞仪检测二甲双胍、紫杉醇作用MCF-7细胞48 h后的细胞周期分布;以Western blot法检测紫杉醇、二甲双胍单独作用或联合作用MCF-7细胞48 h后MAPK通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白的表达。 结果 较低浓度的二甲双胍（0.25～4.00 mmol/L）与紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）联合作用具协同效果（CI<1）;sp600125可显著抑制MCF-7细胞增殖，联合二甲双胍与紫杉醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用明显强于二者单独作用;二甲双胍与紫杉醇联合时G2/M期细胞少于紫杉醇单药应用，多于二甲双胍单药应用;二甲双胍与紫杉醇联合作用MCF-7细胞48 h后p-JNK/SAPK、p-p38蛋白表达明显高于二者单用，p-ERK、Bcl-2蛋白表达降低（P < 0.05）。 结论 二甲双胍联合紫杉醇作用人乳腺癌细胞MCF-7具协同效果，其与sp600125联合时对细胞的抑制作用显著增强。二甲双胍与紫杉醇联合作用还可抑制细胞在G2/M期聚集及ERK通路，激活JNK、p38通路，降低Bcl-2与Bax蛋白比例。

[关键词] 二甲双胍;紫杉醇;乳腺癌;MCF-7细胞;MAPK通路

[中图分类号] R655.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（b）-0017-06

[Abstract] Objective To explore the role mechanism of Metformin combined with Paclitaxel in inducing apoptosis of human breast cancer cell MCF-7. Methods CCK-8 kit was used to detect the 50% inhibitory concentration （IC50 value） of cell proliferation after 48 h of single action of different concentrations of Metformin （0.25， 0.50， 1.00， 2.00， 4.00 mmol/L） or Paclitaxel （0.025， 0.050， 0.100， 0.200， 0.400 μmol/L） or two combined action on MCF-7 cell. And the flow cytometry was used to detect the cell cycle distribution after 48 h action of Metformin or Paclitaxel on MCF-7 cell. And Western blot method was used to detect the expression levels of MAPK pathway protein and Bcl-2， Bax proteins after 48 h of single action of Paclitaxel or Metformin or two combined action on MCF-7 cell. Results Low concentration of Metformin （0.25-4.00 mmol/L） combined with Paclitaxel （0.025-0.400 μmol/L） had a synergistic effect （CI<1）. sp600125 could significantly inhibite MCF-7 cell proliferation， and the inhibitory effect of MCF-7 cell proliferation by Metformin combined with Paclitaxel was stronger than that by single action of the two. The number of G2/M phase cells by combined action of Metformin and Paclitaxel were less than by single action of Paclitaxel， but more than by single action of Metformin. The expression levels of p-JNK/SAPK and p-p38 proteins after 48 h of Metformin combined with Paclitaxel on MCF-7 cell were significantly higher than those by single action of the two， and the expression levels of p-ERK and Bcl-2 proteins were decreased （P < 0.05）. Conclusion Metformin combined with Paclitaxel has a synergistic effect on human breast cancer cell MCF-7， and its inhibitory effect on cells is significantly enhanced when combined with sp600125. Metformin combined with Paclitaxel can inhibit cell aggregation and ERK pathway in G2/M phase， activate JNK and p38 pathway， and reduce the ratio of Bcl-2 and Bax proteins.

[Key words] Metformin; Paclitaxel; Breast cancer; MCF-7 cell; MAPK pathway

乳腺癌系全球妇女发病率最高的恶性肿瘤，每年有130万名以上女性被诊断出患有乳腺癌，且患病人数持续增加，不仅严重威胁女性健康和生活质量，还给全球卫生系统带来沉重负担[1-2]。化疗是目前治疗乳腺癌的重要手段，可有效降低患者体内的瘤细胞载量。紫杉醇类化合物是当前国际公认的新型抗肿瘤药物，可阻滞肿瘤细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡，被证实对乳腺癌有确切疗效[3]。二甲双胍是治疗2型糖尿病的胰岛素增敏剂，临床应用广泛。周寒丽等、郑亚等[4-5]研究发现，二甲双胍还具有降低肿瘤发病风险、抑制肿瘤生长的作用，联合应用二甲双胍和化疗药物可有效抑制各种表型的乳腺癌细胞增殖，且比单用化疗药物效果更加明显。本研究通过分析二甲双胍联合紫杉醇对人乳腺癌细胞MCF-7增殖凋亡的影响，探讨药物作用过程中与MAPK通路、Bcl-2基因家族之间的关系，进一步探讨二甲双胍联合紫杉醇对乳腺癌作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

MCF-7细胞（中国科学院上海细胞库）、二甲双胍片（上海北杰集团关东药业有限公司，生产批号：20 141013，0.25 g，10粒）、紫杉醇注射液（海口市制药厂有限公司，生产批号：20130127，30 mg，5支）、DTC-3G plus型PCR仪（西安天隆科技有限公司）、BD Biosciences FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）、1040×740× 2050超净工作台（深圳净蓝公司）、M301624 CO2培养箱[西化仪（北京）公司]、SZKT2040电泳装置（武汉免疫实验室）、BTNTA2020D凝胶成像分析系统（北京宾达英创科技公司）、CP62-JSM-6390LV电子显微镜（北京中西远大科技公司）、JA12002精密天平（北京易斯高科电子技术有限公司）、胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）、CCK8试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，生产批号：20131025）、ERK通道阻断剂U0126、MAPK通路蛋白一抗（美国Cell Signaling公司）、JNK通路阻断剂sp600125（美国Cayman公司）、Bcl-2、Bax一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7细胞常规培养于高糖DMEM培养液（含10% FBS），置于37℃含5%CO2饱和湿度条件下的温箱孵育，待细胞生长至对数期时加药。

1.2.2 CCK8检测 使用0.25%胰酶消化对数期MCF-7细胞后分别接种到96孔板（按照1×104个/孔），培养24 h后，加入不同浓度（0、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00 μmol/L）的二甲双胍或紫杉醇分别作用细胞，分别设3个复孔及3个对照孔，培养48 h后弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振摇10 min溶解完全后，使用酶联免疫酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值（OD值），计算二甲双胍、紫杉醇对MCF-7细胞增殖的半抑制浓度（IC50值）。单药实验：在MCF-7细胞中分别以相应浓度比加入二甲双胍（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）、紫杉醇（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 μmol/L）。联合用药实验：分别以相应的浓度比在MCF-7细胞中加入二甲双胍、紫杉醇。根据中效原理及CombiDrug统计软件，绘制剂量-效应曲线及不同效应下合用指数曲线（Fa-CI曲线），定量分析两者间的协同、拮抗或相加关系（合用指数CI<1为协同作用，CI=1为相加作用，CI>1为拮抗作用）。DMSO充分溶解10 mmmol/L U0126及1 mmol/L sp600125后，配制成20 μmol/L的终浓度作用，DMSO浓度<0.2%，并按照此方法检测MCF-7细胞增殖。

1.2.3 细胞周期测定 分为对照组、紫杉醇组（TXT 0.05 μmol/L）、二甲双胍组（MET 0.5 mmol/L）及聯合组（0.05 μmol/L TXT+0.5 mmol/L MET），MCF-7细胞生长至对数期加药，48 h后获得1×104个细胞，加1 mL生理盐水离心5 min（转速1200 r/min，离心半径15 cm），重复3次;加100 μL 0.9%的氯化钠溶液混合均匀后，再加入1 mL 75%酒精混匀;加入约50 μL碘化丙啶至终浓度达到65 μg/mL，4℃温度下孵育30 min，经流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4 Western blot分析 细胞分组方式同细胞周期测定，收集处理48 h后的细胞，PBS液冲洗3次，加入250～500 μL预冷至0℃裂解液，置于低温4℃冰箱中30 min，细胞裂解后转移至EP管，4℃下离心5 min（转速1200 r/min，离心半径15 cm），取上清液于新的EP管，-20℃保存。使用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，加入1×SDS上样缓冲液，混匀后100℃条件下煮沸5 min，使其充分变性，冷却后分装，低温-20℃保存。每泳道加入100 μg蛋白，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经80 V稳压电泳至溴酚蓝指示剂跑完浓缩胶层后，100 V稳压电泳至彩虹Marker 28 kD迁移至分离胶下缘，电泳结束（约150 min）。切取目的胶块，100 V稳压电将电泳产物转移至硝酸纤维膜，经5% BSA封闭液封闭2 h，加入MAPK通路蛋白一抗（1∶1000）、Bcl-2及Bax一抗（1∶500），4℃温度下孵育过夜。孵育后的膜使用TBST缓冲液冲洗3次（5 min/次），辣根过氧化物酶标记二抗，置于37℃下作用1.5 h，将其作1∶2000稀释。然后使用TBST缓冲液冲洗3次（5 min/次），ECL化学发光法显色5 min，压片保存。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 单药及联合用药IC50值比较

二甲双胍与紫杉醇联合作用于细胞48 h后，細胞抑制率显著强于二者单药作用，见表1。较低浓度的二甲双胍（0.25～4.00 mmol/L）与紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）联合作用具协同效果（CI<1），随药物浓度增加，趋于相加或拮抗作用（CI≥1），见图1。

2.2 对MCF-7细胞增殖的抑制作用

sp600125可显著抑制MCF-7细胞增殖，联合二甲双胍与紫杉醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用明显强于二甲双胍、紫杉醇单药应用;U0126抑制MCF-7细胞增殖的作用不显著（P > 0.05），与sp600125联用，可拮抗sp600125抑制MCF-7细胞增殖的作用。同时阻断MEK1/2、JNK两条通路，二甲双胍与紫杉醇抑制MCF-7细胞增殖的作用并无显著增强（P > 0.05）。见图2。

2.3 对MCF-7细胞周期的影响

紫杉醇可使MCF-7细胞阻滞在G2/M期，二甲双胍阻滞在G1期，二者联合用药阻滞在G1期，但G1期细胞少于对照组，G2/M期细胞多于对照组。二甲双胍与紫杉醇联合的协同作用并无细胞周期协同效果，且G2/M期细胞少于紫杉醇单药应用，多于二甲双胍单药应用。见表2、图3。

2.4 对MCF-7细胞MAPK蛋白及凋亡蛋白作用

单药作用及联合作用MCF-7细胞48 h后收获蛋白，紫杉醇组及联合组p-ERK1/2蛋白明显低于对照组及二甲双胍组，PINK/SAPK蛋白表达增加，MET组对MAPK通路蛋白的作用没有紫杉醇组显著。联合组p-JNK/SAPK、p-p38蛋白表达明显高于紫杉醇组与二甲双胍组，PERK1/2蛋白表达降低。作用MCF-7细胞48 h后，紫杉醇组、二甲双胍组都可使凋亡蛋白Bcl-2表达降低，且联合组效果更加显著。但Bax蛋白并未发生显著改变。见图4～5、表3～4。

3讨论

肿瘤的发生与肿瘤细胞的过度增殖和凋亡减少有关，而撕裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞信号传递的重要通路，哺乳动物实验中已明确其成员ERK、p38、JNK、ERK5与乳腺癌发病密切相关[6]。其中ERK1/2信号传导是细胞增殖的重要通道，p38和JNK信号可促进乳腺癌细胞凋亡及迁移。同时，细胞凋亡是受抑制细胞凋亡基因（Bcl-2等）和促细胞凋亡基因（Bax等）共同调控的复杂生理过程。在细胞内，二者可结合成异质二聚体而失活，而当二者相对表达量失衡时，则引起细胞凋亡进程改变。国内外多项研究证实[7-9]，Bcl-2蛋白高表达不仅可直接影响乳腺癌患者预后，其基因家族还在多种肿瘤的形成过程及肿瘤化疗药物耐药形成中起关键作用。

本研究通过体外二甲双胍联合紫杉醇作用人乳腺癌细胞MCF-7，观察MAPK通路及Bcl-2基因家族对细胞增殖的抑制作用，结果提示二者均可在体外抑制MCF-7细胞生长。紫杉醇是目前国际公认的新型抗肿瘤药物，可促进微管蛋白聚合，使癌细胞停滞于G2/M期，阻滞肿瘤细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡，继而发挥抗肿瘤作用。Akyol等[10-12]多项研究发现，紫杉醇诱导MCF27细胞凋亡时Bcl-2表达水平显著降低，且伴随着Bcl-2磷酸化，Bcl-2不能与同源的Bax结合，使游离Bax表达水平显著增高，促进细胞凋亡，同时bcl-2/Bax比率具明显的时间及剂量依赖性。二甲双胍是20世纪中叶用于治疗2型糖尿病的胰岛素增敏剂，近几年对结直肠癌、神经胶质瘤和生殖系统肿瘤的细胞及动物实验研究发现，二甲双胍可抑制抗凋亡的Bcl-2基因表达，促进促凋亡的Bax基因表达，调控细胞凋亡平衡，抑制肿瘤生长，改善患者预后[13-15]。本研究显示，较低浓度的二甲双胍（0.25～4.00 mmol/L）与紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）联合作用具协同效果。药物浓度增加后，联合组效果趋于拮抗作用，但细胞周期并不是单纯的协同或拮抗作用，联合组G2期细胞显著少于紫杉醇组，可认为紫杉醇在细胞周期的阻断作用中占主导低位，二甲双胍可拮抗部分紫杉醇抗微管作用，因此联合组G2期细胞介于紫杉醇组与二甲双胍组之间。

本研究中sp600125可显著抑制MCF-7细胞增殖，其联合紫杉醇与二甲双胍的抑制作用强于单药作用，提示JNK通路对药物发挥疗效促进肿瘤细胞凋亡具重要作用。JNK通路活化可介导细胞凋亡，但一定条件下，也可起到提高细胞存活能力，促进肿瘤进展的作用。sp600125作为JNK通路阻断剂，可抑制JNK下游蛋白磷酸化，降低肿瘤细胞活性，且具一定剂量依赖性[16-18]。本研究中JNK通路虽然被阻断，但联合组抑制作用并未有显著增强，提示紫杉醇与二甲双胍联合JNK通路并未起到明显的促进细胞存活作用。U0126可通过抑制细胞黏附作用及血管生长起到抑制肿瘤侵袭与转移的作用，从而诱导肿瘤凋亡[19]。但本研究中此种抑制作用并不明显，U0126与sp600125联用反而会对sp600125的抑制作用起到拮抗效果。且阻断ERK1/2及JNK通路后紫杉醇及二甲双胍对MCF-7细胞的抑制作用并未强于二者单独作用，究其原因可能是由于MAPK是一个独立的复杂系统，交叉作用广泛，难以确保以某个点或通路为靶向。

本研究联合组p-ERK蛋白表达水平明显低于紫杉醇组与二甲双胍组，p-JNK及p-p38蛋白水平明显高于紫杉醇组与二甲双胍组，提示紫杉醇与二甲双胍联合可抑制ERK通路，激活JNK、p38通路，使下游蛋白表达变化，从而促进细胞凋亡，且细胞存活与凋亡均与ERK、JNK、p38通路间的动态平衡相关。紫杉醇与二甲双胍联合作用中，ERK、JNK、p38蛋白因药物协同作用而发生适应性变化，MAPK通路蛋白表达水平的变化可能也与这种动态平衡相关。

肿瘤细胞中Bcl-2基因表达水平较高可促进肿瘤进展，Bcl-2基因表达降低或缺失可抑制肿瘤生长[20]。本研究联合组作用MCF-7细胞后Bcl-2蛋白表达水平显著低于紫杉醇组与二甲双胍组，Bax蛋白表达水平略有提高，可认为Bcl-2与Bax基因间存在动态平衡，可调控肿瘤细胞的分裂与死亡。联合组协同作用可降低Bcl-2与Bax蛋白比例，下调Bcl-2通路，从而增强紫杉醇对MCF-7细胞的敏感性，且与MCF-7细胞雌激素受体（ER）表达相关。因此，临床治疗过程中可通过调控Bcl-2家族表达，增强紫杉醇对ER（+）乳腺癌的化疗敏感性，更好地改善乳腺癌患者预后。

综上所述，体外低剂量二甲双胍联合紫杉醇作用人乳腺癌细胞MCF-7具协同作用，可抑制细胞在G2/M期聚集及ERK通路，激活JNK、p38通路，降低Bcl-2与Bax蛋白比例，下调Bcl-2通路，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制肿瘤生长。

[参考文献]

[1] 陈万青，郑荣寿.中国女性乳腺癌发病死亡和生存状况[J].中国肿瘤临床，2015，42（13）：668-674.

[2] 石建伟，唐智柳，蔡美玉，等.2008～2012年我国女性乳腺癌流行状况的系统性综述[J].中国妇幼保健，2014，29（10）：1622-1626.

[3] 张龙，王凤玮.紫杉醇用于乳腺癌治疗的应用进展[J].中国医药导报，2014，11（31）：167-168.

[4] 周寒丽，耿健雄，张华.二甲双胍抗肿瘤机制的研究进展[J].现代肿瘤医学，2015，23（12）：1760-1763.

[5] 郑亚，孙红.二甲双胍联合化疗药对妇科肿瘤的作用[J].现代妇产科进展，2016，25（11）：856-858.

[6] 吴婧，王宁菊，马吉光.MAPK蛋白在乳腺癌中的表达及其意义[J].宁夏医科大学学报，2014，36（7）：743-745.

[7] 郝磊，魏现娟，郝坤.p53及bcl-2蛋白在乳腺癌中表达的相关性研究[J].中国妇幼保健，2017，32（4）：695-697.

[8] Pusztai L，Krishnamurti S，Perez CJ，et al. Expression of BAG-1 and BcL-2 proteins before and after neoadjuvant chemotherapy of locally advanced breast cancer [J]. Cancer Invest，2015，22（2）：248-256.

[9] Noh KT，Cha GS，Kang TH，et al. Enhancement of paclitaxel-induced breast cancer cell death via the glycogen synthase kinase-3β-mediated B-cell lymphoma 2 regulation [J]. Bmb Rep，2016，49（1）：51-56.

[10] Akyol Z，？覶oker-Gürkan A，Arisan ED，et al. DENSpm overcame Bcl-2 mediated resistance against Paclitaxel treatment in MCF-7 breast cancer cells via activating polyamine catabolic machinery [J]. Biomed & Pharmacother，2016，84：2029-2041.

[11] 馬骥，余惠云，刘颖，等.二甲双胍抗肿瘤效应的基础与临床研究进展[J].现代生物医学进展，2015，15（33）：6587-6589.

[12] Queiroz EAIF，Puukila S，Eichler R，et al. Metformin Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest Mediated by Oxidative Stress，AMPK and FOXO3a in MCF-7 Breast Cancer Cells [J]. PLoS One，2014，9（5）：e98207.

[13] 赵松，杨金刚，李长岭，等.蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32（10）：1321-1326.

[14] Choi JE，Su HK，Lee SJ，et al. Prognostic significance of Bcl-2 expression in non-basal triple-negative breast cancer patients treated with anthracycline-based chemotherapy [J]. Tumor Biol，2014，35（12）：12 255-12 263.

[15] Chen L，Bourguignon LYW. Hyaluronan-CD44 interaction promotes c-Jun signaling and miRNA21 expression leading to Bcl-2 expression and chemoresistance in breast cancer cells [J]. Mol Cancer，2014，13（1）：52.

[16] 王琼，王佑民，毋飞飞，等.JNK通路在高糖促人乳腺癌MCF-7细胞增殖中的作用[J].安徽医科大学学报，2014， 49（2）：149-154.

[17] Urrutia A，Rubio-Araiz A，Gutierrez-Lopez MD，et al. A study on the effect of JNK inhibitor，SP600125，on the disruption of blood-brain barrier induced by methamphetamine [J]. Neurobiol Dis，2013，50（1）：49.

[18] Jemaà M，Vitale I，Kepp O，et al. Selective killing of p53-deficient cancer cells by SP600125 [J]. Embo Mol Med，2012，4（6）：500.

[19] Si L，Zheng L，Xu L，et al. Dioscin suppresses human laryngeal cancer cells growth via induction of cell-cycle arrest and MAPK-mediated mitochondrial-derived apoptosis and inhibition of tumor invasion [J]. Eur J Pharmacol，2016，774（4）：105-117.

[20] 饶国洲，娄鸣，景娟，等.survivin和bcl-2双基因敲减对人舌癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J].陕西医学杂志，2017， 46（2）：145-147.

（收稿日期：2018-07-16 本文编辑：任 念）