上皮性卵巢癌组织中CD44、Nanog的表达及临床意义

杜文升 魏敏

[摘要] 目的 探討上皮性卵巢癌组织中CD44、转录因子Nanog的表达水平及其临床意义。 方法 收集2012年1～12月于徐州医科大学附属医院行手术治疗的80例上皮性卵巢癌患者的卵巢组织标本为病例组，并于同期随机选取60例良性卵巢肿瘤患者卵等组织标本为对照组。采用免疫组织化学法检测各组标本中CD44、Nanog的表达水平。 结果 病例组CD44、Nanog阳性表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P <; 0.05）。肿瘤直径≥3 cm、肿瘤低分化、浸润深度T3+T4期、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移的上皮性卵巢癌患者组织中CD44、Nanog阳性表达率高于肿瘤直径<;3 cm、中高分化、浸润深度T1+T2期、FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（P <; 0.05）。Spearman秩相关分析显示病例组患者组织中CD44与Nanog表达呈正相关（rs = 0.592，P <; 0.05）。CD44阳性表达者5年生存率低于CD44阴性者，Nanog阳性表达者5年生存率低于Nanog阴性者，差异有统计学意义（P <; 0.05）。 结论 CD44、Nanog表达上调参与了上皮性卵巢癌的发生、发展过程，早期检测可作为临床辅助诊断上皮性卵巢癌、评估病情严重程度及预测预后的重要标志物。

[关键词] 上皮性卵巢癌;CD44;Nanog;临床意义

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（b）-0082-05

[Abstract] Objective To explore the expression levels of CD44 and transcription factor Nanog in tissues with epithelial ovarian cancer and its clinical significance. Methods A total of 80 ovarian tissues of patients with epithelial ovarian cancer treated by operation in Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from January to December 2012 were collected as case group. At the same time， 60 ouarian tissues of patients with benign ovarian tumors were randomly selected as control group. The expression levels of CD44 and Nanog of two groups were detected by immunohistochemistry. Results The positive expression rate of CD44 and Nanog in case group were both higher than the control group， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. The positive rate in patients with tumor diameter ≥ 3 cm， low differentiation， T3+T4 stage of infiltration depth， FIGO stage Ⅲ+Ⅳ， lymph node metastasis were higher than those with tumor diameter <;3 cm， medium and high differentiation， T1+T2 stage of infiltration depth， FIGO stage Ⅰ+Ⅱ， no lymph node metastasis， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. Spearman rank correlation analysis showed that a positive correlation between CD44 and Nanog expression in case group was found （rs = 0.592， P <; 0.05）. The 5-year survival rate in patients with CD44 positive expression was lower than that in patients with CD44 negative expression， and the 5-year survival rate in patients with Nanog positive expression was lower than that in patients with Nanog negative expression， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. Conclusion The up-regulated expression of CD44 and Nanog is involved in the occurrence and development of epithelial ovarian cancer. Early detection of CD44 and Nanog can be used as an important markers for diagnosing epithelial ovarian cancer and evaluating the severity of disease and predicting prognosis.

[Key words] Epithelial ovarian cancer; CD44; Nanog; Clinical significance

上皮性卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，占卵巢恶性肿瘤的85%～90%，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，死亡率居妇科恶性肿瘤首位[1]。早期诊断困难，确诊时已近中晚期，患者5年生存率仅为30%～40%[2]。因此，寻找灵敏度高、特异性好的标志物辅助临床诊断并评估病情严重程度具有重要意义。CD44属于细胞黏附分子家族成员，是一种跨膜糖蛋白，在细胞间或者细胞与基质间以跨膜糖蛋白方式发挥作用，CD44与细胞黏附、血管形成、肿瘤细胞浸润及增殖密切相关[3]。研究显示[4-5]，CD44表达异常参与了胃癌、肺癌等恶性肿瘤的发病过程。Nanog是主要在多能胚胎干细胞中呈高表达而发挥维持胚胎干细胞多潜能性的关键转录因子，研究发现[6]，Nanog可能是癌变起源的靶细胞，其高表达对肿瘤的发生有促进作用。关于CD44、Nanog表达与上皮性卵巢癌发病的关系，目前相关研究相对较少，本研究旨在探讨其关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1～12月徐州医科大学附属医院（以下简称“我院”）手术切除的80例上皮性卵巢癌患者的卵巢组织标本为病例组。纳入标准：①组织标本经病理学确诊为上皮性卵巢癌;②首次手术且术前未接受任何放、化疗，也未行肿瘤免疫治疗者;③临床病理资料完整，且随访资料完整者。排除标准：①孕产妇及哺乳期的妇女;②心脏功能不全者;③肝、肾功能障碍者;④术前6个月内服用过雌、孕激素类药物者;⑤其他恶性肿瘤患者。患者年齡34～76岁，平均（56.8±13.3）岁;肿瘤直径2.6～8.3 cm，平均（5.3±1.6）cm;肿瘤病理类型：局限型47例，浸润型33例;病理类型：浆液性53例，黏液性27例;肿瘤分化程度：低分化51例，中、高分化29例;国际妇产科联盟（FIGO）分期标准[7]：Ⅰ+Ⅱ期46例，Ⅲ+Ⅳ期34例;淋巴结转移35例，无淋巴结转移45例。并于同期随机选取60例于我院行卵巢肿瘤切除术的良性卵巢肿瘤患者的卵巢组织标本为对照组，患者年龄29～75岁，平均（54.9±14.5）岁。两组患者年龄比较，差异无统计学意义（P >; 0.05），具有可比性。本研究得到我院医学伦理委员会的批准，研究对象及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂 SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）、DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）;一抗兔抗人CD44单克隆抗体（英国Abcam公司）、一抗兔抗人Nanog多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（二抗）抗体（北京中杉金桥生物科技有限公司）。

1.2.2 免疫组化 对卵巢组织切片进行包埋，二甲苯和酒精脱蜡后以蒸馏水漂洗5 min，常温环境下以浓度为3%的H2O2灭活10 min，水洗;以乙二胺四乙酸（EDTA）稀释10倍后在微波炉下大火煮7～8 min，在室温下冷却5 min，再以大火煮7～8 min，通过微波进行热修复，冷却30 min直至其恢复至室温，滴加浓度为5%的牛血清白蛋白（BSA），在37℃恒温箱中孵育，30 min后做封闭处理;滴加一抗后在37℃恒温箱中孵育2 h，以磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤5 min，反复3次;抗体稀释的浓度为1∶100;滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG在37℃恒温箱中孵育30 min，再以PBS洗涤5 min，反复3次;滴加链霉亲和素-生物素复合物（SABC），并在37℃恒温箱中孵育30 min，以PBS洗涤5 min，反复3次;DAB显色后复染，返蓝后封片处理，在显微镜下观察染色结果。上述操作严格按照免疫组化SP试剂盒上的说明书进行。

1.2.3 结果判定 CD44阳性染色细胞在细胞膜中表达，Nanog阳性染色细胞主要在细胞核中表达，少部分在细胞浆中表达，阳性细胞表达强度判定根据阳性染色细胞所占的百分比与染色强度计算[8-9]：在光镜下，随机选取10个高倍镜视野计算1000个细胞中阳性染色细胞所占的百分比：阳性染色细胞数所占的百分比<;5%记为0分，5%～25%记为1分，>;25%～50%记为2分，>;50%～75%记为3分，>;75%则记为4分;根据阳性细胞的染色强度进行评分，染色呈淡黄色计为1分，染色呈棕黄色计为2分，染色呈棕褐色计为3分。两种评分的乘积则为最终阳性强度评分，最终积分≤3分计为阴性（-），>;3分计为阳性（+）。

1.3 随访

术后对患者进行随访，随访方式包括电话随访或者门诊随访，随访结局为患者3、5年生存情况，随访期限为术后5年。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验;采用Spearman秩相关分析CD44与Nanog之间的相关性。以P <; 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者卵巢组织标本中CD44、Nanog表达水平比较

病例组患者卵巢组织中CD44、Nanog阳性表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P <; 0.05）。见表1。

2.2 病例组患者卵巢组织中CD44、Nanog表达与临床病理特征的关系

上皮性卵巢癌患者卵巢组织中CD44、Nanog的表达与肿瘤直径、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移情况有关，差异有统计学意义（P <; 0.05）。见表2。

2.3 病例组患者卵巢组织中CD44、Nanog表达的相关性分析

经Spearman秩相关分析，病例组患者组织中CD44与Nanog表达呈正相关（rs = 0.592，P <; 0.05）。

2.4 CD44、Nanog不同阳性表达强度的上皮性卵巢患者预后分析

CD44、Nanog阳性表达者与阴性表达者3年生存率比较，差异无统计学意义（P >; 0.05）;CD44阳性表达者5年生存率低于CD44阴性组，Nanog阳性表达组5年生存率低于Nanog阴性组，差异有统计学意义（P <; 0.05）。见表3。

3 讨论

CD44是广泛存在于细胞之间的跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族成员，通过特异性结合透明质酸而参与淋巴细胞的归巢、淋巴细胞向黏膜相关淋巴组织以及炎症部位转移等，并介导细胞之间或者细胞与基质之间的特异性黏附过程[10]。研究显示[11]，CD44与肿瘤细胞的增殖、浸润、转移等密切相关，其机制主要包括：恶性肿瘤细胞之间的同质型黏附作用减弱，异质型黏附性明显增强，其中减弱的同质型黏附使原发灶的肿瘤细胞脱离，增强的异质型黏附促进恶性肿瘤细胞借助黏附作用发生远处转移。李威等[12]研究发现，CD44参与了胃癌的发生发展过程，并且与恶性肿瘤细胞的侵袭、转移、复发密切相关，是预测胃癌预后的重要标志物。此外，研究表明CD44还介导了乳腺癌[13]、鼻咽癌[14]等恶性肿瘤的发病过程。

Nanog是胚胎干细胞中的特异性表达基因，主要在早期胚胎以及生殖干细胞中表达，其功能包括维持胚胎干细胞的自我更新以及多向分化。Nanog分子氨基端含有的苏氨酸、丝氨酸以及脯氨酸等，其在磷酸化作用下可被修饰，而羧基端则具有转录激活的功能[15]。Liu等[16]发现卵巢癌患者组织中Nanog异常表达，敲除Nanog基因后可抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭。研究显示[17-18]，Nanog表达上调参与了乳腺癌、直肠癌等恶性肿瘤的发生、发展，并且与肿瘤细胞的浸润、淋巴结转移等密切相关。另有研究报道[19]，Nanog表达上调对预测食管癌患者生存时间有重要意义。

本研究结果显示，病例组患者卵巢组织中CD44、Nanog阳性表达率高于对照组，提示CD44、Nanog通过异常表达而参与上皮性卵巢癌的发病过程。肿瘤大小及其临床分期、组织的分化程度、肿瘤浸润组织的深度以及淋巴结转移等均反映了肿瘤的发生发展过程，并且与病情严重程度密切相关，肿瘤越大及浸润组织越深，临床分期越晚，组织分化程度越低，有远处淋巴结转移患者病情越严重。本研究结果中，上皮性卵巢癌患者组织中CD44、Nanog异常表达与肿瘤大小及临床分期、组织分化程度、肿瘤浸润深度以及淋巴结转移有关，肿瘤直径≥3 cm、肿瘤低分化、浸润深度T3+T4期、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移患者组织中CD44、Nanog表达阳性率明显升高，即患者恶性程度越高，CD44、Nanog表达阳性率越高，提示CD44、Nanog介导了上皮性卵巢癌发生、发展过程，是评估病情严重程度的重要指标，与有关研究结果相似[2，20]。

Spearman秩相关分析结果显示，上皮性卵巢癌患者组织中CD44与Nanog表达呈正相关，提示两者促癌作用具有协同性，通过相互促进共同介导上皮性卵巢癌的发病过程，但是其作用机制需进一步研究。马琳等[11]研究发现，CD44阳性表达是预测卵巢癌患者5年生存率的危险因素，CD44阳性表达越强，患者5年生存率越低。李秀娟等[19]发现，Nanog表达阳性的食管癌患者5年生存率低于Nanog阴性表达者。本研究中，CD44阳性表达者5年生存率低于CD44阴性者，Nanog阳性表达者5年生存率低于Nanog阴性表达者，而CD44、Nanog阳性表达者与阴性表达者3年生存率比较，差异无统计学意义（P >; 0.05），提示CD44、Nanog表达上调与上皮性卵巢癌患者生存时间有关，两者可作为预测患者远期预后的标志物。

综上所述，CD44、Nanog通过表达上调而参与上皮性卵巢癌的发生、发展过程，两者通过协调作用而发挥促癌功能，并且其与患者病情进展及远期预后密切相关，早期检测对辅助临床诊断上皮性卵巢、评估病情严重程度和判断预后有重要价值。

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（收稿日期：2018-05-17 本文编辑：任 念）