姜黄素对2型糖尿病模型大鼠肝脏组织PTP1B、IRS—2 mRNA表达的影响

秦培洁 张东伟 高思华 刘剑锋

[摘要] 目的 观察姜黄素对高脂饮食诱导的2型糖尿病模型大鼠肝脏组织蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）mRNA表达的影响。 方法 SD大鼠经高脂饲料喂养后对尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）来制备2型糖尿病模型，将其分层随机分为模型组、姜黄素组、吡格列酮组，每组10只。分别在给药第4、8周后，测定空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FINS）、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，计算肝脏指数（LI）、胰岛素敏感指数（ISI）。给药第8周肝脏HE染色观察其病理变化，Real-time PCR法检测肝脏PTP1B、IRS-2 mRNA表达。 结果 姜黄素组相较于模型组能够显著降低2型糖尿病大鼠的体重、FBG、FINS、LDL-C水平（P < 0.05），增加胰岛素敏感性，改善肝脏组织脂肪变性和炎性反应，抑制PTP1B mRNA表达，上调IRS-2 mRNA表达（P < 0.05）。 结论 姜黄素能够改善2型糖尿病模型大鼠的胰岛素抵抗，其作用机制可能与抑制PTP1B mRNA表达、上调IRS-2 mRNA表达有关。

[关键词] 姜黄素；2型糖尿病；蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B；胰岛素受体底物-2

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0014-04

唐代《新修本草》中首载了植物姜黄的功效——破血行气、通经止痛、祛风痹痛、消疮痈肿痛、利胆等。现代科学研究发现，姜黄中的主要有效成分为姜黄素（curcumin）[1]。姜黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性，而近年来对姜黄素的研究发现，姜黄素还具有降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用。本研究以高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠为研究对象，应用姜黄素对其进行干预，观察姜黄素对肝脏组织蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）mRNA表达的影响，探讨其改善胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

姜黄素粉（质量分数99%），购自Sigma公司（BC BL0422G）；Trizol RNA提取试剂，购自Invitrogen公司（15596025）；链脲佐菌素（STZ），购自Sigma公司（S0129）；吡格列酮片，购自北京太洋药业有限公司；SYBR Green PCR Master Mix实时荧光定量PCR试剂盒，购自BIO-RAD公司；M-MLV逆转录酶，购自Promega公司；引物，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 动物模型制备与分组

1.2.1 实验动物 实验动物选取SD大鼠60只，3月龄，体重（270±20）g，SPF级，天津医科大学动物实验中心提供。所有动物按照清洁级动物管理标准，饲养于天津医科大学动物实验中心动物房，光照/黑暗时间12 h/12 h，室温恒温（25±3）°C。

1.2.2 模型制备方法 SD大鼠经高脂饲料喂养后对尾静脉注射STZ来制备2型糖尿病模型。

1.2.3 分组与给药 ①选取SD雄性大鼠60只，随机选取其中50只进行4周的高脂高热卡饲料（高脂饲料配方：蔗糖20%、胆固醇2.5%、猪油10%、胆酸钠1%、基础饲料77.5%）喂养，检测空腹血清胰岛素（FINS）水平。②第一步的50只大鼠进行8周的高脂高热卡喂养然后尾静脉注射STZ，检测随机血糖，如果超过16.9 mmol/L，则视为2型糖尿病模型制备成功（成模率为80%）（40只，高脂组）。③选取造模成功的30只2型糖尿病大鼠分层随机（按血糖、体重）分为三组，每组10只，分别为模型组、吡格列酮组、姜黄素组。按照人鼠等效剂量，吡格列酮组、姜黄素组分别给予吡格列酮（人鼠等效剂量为1.35 mg/kg）和姜黄素（人鼠等效剂量为100 mg/kg）[2]，模型组每日用等量无菌饮用水灌胃。④正常组则是普通饲料喂养的SD大鼠10只，每日给予等量无菌饮用水灌胃。⑤待实验进行到第8周时，处死大鼠，取材、备用。

1.3 观察指标及检测方法

药物干预8周后股动脉取血，放血处死，分离血清。称取肝重（湿重），甲醛固定后冻存。

1.3.1 一般状况 观察各组大鼠饮食情况、精神状态、行为、毛发光泽度、活动状态等。

1.3.2 血脂、空腹血糖（FBG）、FINS、胰岛素敏感指数（ISI）的测定 对大鼠禁食不禁水12 h（8：00 pm～8：00 am），然后取其血，用微量血糖仪测定血糖，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定FINS水平；ISI用李氏法计算，即ISI=ln[1/（空腹胰岛素浓度×空腹血糖浓度）]；采用全自动生化分析仪测定血清血脂，包括血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.3.3 肝脏指数 肝脏指数（LI）=肝重（湿重）/体重×100%。

1.3.4 病理学检查 石蜡切片，HE染色，光镜观察肝脏组织病理变化，主要观察点包括是否有脂肪变性、纤维化及炎症。

1.3.5 肝脏PTP1B、IRS-2 mRNA检测 总RNA提取：根据Trizol试剂的说明进行操作，采用异硫氰酸胍一步法。用1%的琼脂糖凝胶电泳确定所提总RNA的完整性，所提RNA的含量和纯度采用紫外分光光度计检测。cDNA合成：模板是分别取3 μg总RNA，再加入Oligo（dT）和M-MLV逆转录酶后，cDNA第一链是以25 μL体系在42℃下反应1 h合成的，之后加热3 min，温度为94℃来灭活逆转录酶。实时荧光定量PCR扩增：采用SYBR GreenⅠ荧光染料技术，在20 μL反应体系中，加入ddH2O 3 μL、cDNA 6 μL、SYBR Green荧光定量PCR Mix 10 μL、引物1 μL（PTP1B上游引物：5′-TGGCTGTGATCGAGGGTG-3′，下游引物：5′-TGAGGCTCCAATGTGCGTTTGGGTG-3′；IRS-2上游引物：5′-TGCCAACACCCGTCGCTGAC-3′，下游引物：5′-CACCGGTGACGGGTGAACGG-3′）。在CFX-96系统上进行PCR反应及数据采集，记录其循环阈值（Ct），每个样品中靶基因的相对mRNA表达采用相对定量公式2-ΔΔCt计算，其中ΔCt值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

1.4 统计学方法

统计学处理采SPSS 17.0软件进行，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

与正常组大鼠比较，模型组大鼠的精神状态萎靡，懒于运动，性情不活泼，皮毛凌乱且无光泽。吡格列酮组、姜黄素组相较于正常组大鼠也有不同程度的饮食和活动减少，皮毛欠光泽。

2.2 大鼠体重、肝脏指数的变化

高脂喂养前，正常组与高脂组体重差异无统计学意义（P > 0.05），高脂饮食喂养8周后（STZ造模前），与正常组比较，高脂组大鼠体重明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。造模后，模型组和姜黄素组、吡格列酮组体重较正常组明显增加（P < 0.05）；造模2、8周后，姜黄素组大鼠体重比同期模型组明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05），吡格列酮组大鼠体重和同期模型组比较差异则无统计学意义（P > 0.05）。见表1。与正常组比较，模型组肝重和肝脏指数明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，姜黄素组、吡格列酮组肝重和肝脏指数则明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3 大鼠血脂、FBG、FINS、ISI的变化

模型组、姜黄素组、吡格列酮组TC、TG、LDL-C、HDL-C各项指标均较正常组明显升高（P < 0.05）。姜黄素组、吡格列酮组LDL-C较模型组明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。造模4、8周后，模型组FBG、FINS较正常组明显升高，ISI较正常组明显降低（P < 0.05）；姜黄素组、吡格列酮组大鼠FBG较同期模型组明显下降（P < 0.05），但用药8周后吡格列酮组大鼠的FBG有所回升；与同期模型组比较，姜黄素组、吡格列酮组大鼠FINS显著降低，ISI显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.4 肝脏病理学观察

2.4.1 解剖观察 正常组大鼠的肝脏边缘清晰，颜色鲜红，表面光滑，质地有弹性。模型组大鼠的肝脏色土黄，边缘比较钝且质地柔软，体积明显增大，切面呈现明显油腻感，表现为典型的脂肪肝外观。吡格列酮组和姜黄素组的部分肝脏外观接近正常组，但是肝脏颜色还是浅黄，体积有所增大，表面仍有油腻感，但是较之模型组有所减轻。

2.4.2 光镜观察 与正常组大鼠比较，模型组大鼠肝脏的肝细胞呈现重度脂肪变性：肝细胞浆内充斥着大小不等的脂肪空炮，严重者甚至出现整个细胞大空泡样即胞核消失，整个肝细胞完全被脂肪充满。部分出现轻微的纤维化改变：肝细胞呈现溶解坏死，细胞间有少量炎症细胞浸润；与模型组比较，姜黄素组、吡格列酮组大鼠的肝脏病理均有不同程度的改善：病理呈现的脂肪变性主要为轻中度，脂肪变肝细胞数目减少，肝细胞多为正常形态，胞浆丰富，内脂滴减少或者消失，基本没有或者仅见少量炎症细胞浸润，未见纤维改变。见图1（封三）。

2.5 大鼠肝脏组织PTP1B、IRS-2 mRNA表达情况

正常组肝脏组织IRS-2 mRNA呈高水平表达，PTP1B mRNA呈低表达水平。与正常组比较，模型组肝脏组织IRS-2 mRNA表达降低，PTP1B mRNA表达升高（P < 0.05），姜黄素组和吡格列酮组IRS-2 mRNA表达亦明显降低（P < 0.05）。与模型组比较，姜黄素组和吡格列酮组IRS-2 mRNA表达明显增加，PTP1B mRNA表达明显降低（P < 0.05）。见表5。

3 讨论

肝脏出现胰岛素抵抗时的主要表现是肝糖原合成减少，糖异生增加，从而导致整个糖代谢紊乱。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，其本身出现胰岛素抵抗时，主要表现为胰岛素与受体结合后信号转导到细胞内引起的一系列代谢过程障碍。发生在IRS蛋白分子水平上的胰岛素抵抗主要表现为通过降低IRS基因表达，减少蛋白量及功能障碍来影响胰岛素信号的有效传导，进而导致胰岛素抵抗。IRS-2主要表达在肝脏和胰岛β细胞，小鼠敲除IRS-2基因后，则会发生外周胰岛素抵抗以及代偿性胰岛素分泌不足，说明IRS-2蛋白是联系外周胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷的重要介质[3]。类固醇调节元件结合蛋白（SREBP）是IRS-2调控脂质合成的重要枢纽，下调IRS-2可影响其下游PI3K/Akt信号转导，进而减少肝糖原的合成，增加脂肪的合成，这些现象均提示肝细胞肝脏胰岛素抵抗与肝细胞的脂肪变性呈现高度相关性[4]。小鼠敲除PTP1B基因后会免遭饮食诱导的肥胖，考虑与增加了基礎代谢率和总能量消耗有关，表明缺乏PTP1B基因的小鼠的胰岛素敏感性明显增加，肝脏、肌肉中的胰岛素受体磷酸化水平增强，这提示PTP1B是体内能量平衡、胰岛素敏感性和体脂贮存的重要调节因素[5]。

课题组在临床研究中发现具有情志问题病史是很多糖尿病患者的共性[6-7]，这恰恰与中医的病先伤于肝者、多为情志所伤的理论契合。情郁、气怒多伤肝，肝伤则失疏泄，疏泄失司，则气血失运，五脏气机升降出入皆紊乱，整个机体新陈代谢的动态变化失衡。故而运化失常，导致水谷精微输布障碍而蓄积于体内，终化为湿、痰、浊，久则郁热、湿滞、血瘀等相互搏结，则出现高血糖、高血脂等一系列糖、脂代谢异常。课题组经过多年临床实践，根据这一系列病理变化而针对性地采取疏肝行气为主、健脾益肾为辅的治则，以郁金、姜黄为主药。而郁金、姜黄的主要活性成分是姜黄素，现代药理研究发现其具有降血脂、防治糖尿病等多种作用[8]。本研究结果进一步提示，姜黄素可以降低高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠的体重、血糖、空腹FINS，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗；同时可以降低血脂（主要是LDL-C）、肝脏指数，改善脂质代谢及肝脏脂肪变性。在印证糖尿病从肝论治的中医理论的基础上，提示其分子机制可能与抑制PTP1B mRNA表达从而上调IRS-2 mRNA表达有关。

[参考文献]

[1] 贾绍华，张舜尧.姜黄素药理作用研究进展[J].中国现代药物应用，2009，3（22）：188-189.

[2] 陈奇.中药药理研究方法[M].3版.北京：人民卫生出版社，2011：33.

[3] Withers DJ，White M. Perspective：the insulin signaling system--a common link in the pathogenesis of type 2 diabetes [J]. Endocrinology，2000，141（6）：1917-1921.

[4] Ide T，Shimano H，Yahagi N，et al. SREBPs suppress IRS-2-mediated insulin signalling in the liver [J]. Nat Cell Biol，2004，6（4）：351-357.

[5] Klaman LD，Boss O，Peroni OD，et al. Increased energy expenditure，decreased adiposity，and tissue-specific insulin sensitivity in protein-tyrosine phosphatase 1B-deficient mice [J]. Mol Cell Biol，2000，20（15）：5479-5489.

[6] 龚燕冰，罗增刚，高思华.运用因子分析方法探索2型糖尿病证候要素及其靶位特征[J].中医杂志，2011，52（13）：1100-1102.

[7] 高思华.以中西医结合理论为指导，立足肝脾肾辨治糖尿病[J].中国中西医结合杂志，1994，14（10）：622-623.

[8] Bengmark S. Curcumin，an atoxic antioxidant and natural NFκB，cyclooxygenase-2，lipooxygenase，and inducible nitric oxide synthase inhibitor：a shield against acute and chronic diseases [J]. JPEN，2006， 30（1）：45-51.

（收稿日期：2018-04-23 本文編辑：张瑜杰）