中药活性成分诱导肝细胞癌自噬的体外实验研究进展

林彤 沙永强 陈泽雄

[摘要] 自噬是细胞高度保守的自我更新机制，是机体诸多生理病理过程的核心环节。自噬是肿瘤调控的双刃剑，它抑制早期肿瘤发展，也促进晚期肿瘤生长。肝细胞癌（HCC）复发率高、预后差，目前尚缺少有效的治疗方法。纵观文献，多种抗癌中药活性成分可提高HCC细胞的自噬水平，或引发自噬性死亡，抑制肿瘤；或引发保护性自噬，支持肿瘤生存、削弱抗癌药物疗效。本文对中药活性成分诱导HCC自噬方面的研究成果作一综述，为以自噬为靶标的抗HCC药物研发提供新思路。

[关键词] 自噬；肝细胞癌；中药；活性成分；研究进展

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0049-05

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的90%，是世界上第五常见的癌症，是癌症死亡的第三个原因[1]。虽手术切除、肝移植等对早期患者有效，但大多数患者确诊时已错失手术时机，晚期HCC患者中位生存率在1年以下[2]。中药来源丰富，价格低廉，毒副作用小，极具新一代抗癌药物开发潜力，多种中药抗癌活性成分对各类肿瘤表现出一定的自噬调节作用，本文主要对诱导HCC自噬的中药成分展开论述。

1 自噬

自噬（autophagy）是真核细胞依赖溶酶体降解自身胞质组分的过程，受损细胞器或错误折叠的蛋白质被消化成大分子物质并释放能量供细胞循环利用[3]。细胞自噬一般保持在较低的基础水平，对细胞生长发育、结构重塑、物质更新、稳态维持和代谢平衡有至关重要的作用。当遇到生存压力（饥饿、缺氧等）或损伤应激（氧化应激、基因突变等），自噬水平急剧升高，作为细胞的保护机制，但过度的自噬会导致自噬性死亡（Ⅱ型程序性细胞死亡）[4]，这种细胞死亡因不依赖caspase家族而有别于凋亡。自噬缺陷广泛存在于癌症、代谢障碍、神经退行性病、肌病及衰老的病理过程中[5]。

自噬涉及起始、成核、延伸、自噬溶酶体形成和降解5个步骤，由一系列自噬相关基因（autophagy associated gene，ATG）编码的蛋白质调控。自噬有3种类型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。巨自噬指雙层膜囊泡包裹底物形成“自噬体”，自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体，溶酶体进而分解底物；微自噬指溶酶体表面内陷形成单层膜囊泡，直接包裹底物；CMA指胞浆中的底物同分子伴侣结合后被转运至溶酶体内[4]。本文中的自噬均指巨自噬。

2 自噬与肿瘤的关系

自噬对肿瘤的调控是动态而矛盾的，目前多数学者认为自噬抑制早期肿瘤发展，促进晚期肿瘤生长。自噬防止正常细胞损伤和癌变：①细胞内活性氧簇（ROS）能导致基因突变，其来源是受损的细胞器，自噬清除异常细胞器，避免氧化损伤，保持基因组稳定，防止肿瘤萌生。②炎症环境有助于恶性细胞增殖，并刺激肿瘤血管生成，自噬减轻炎症和坏死，塑造不利于肿瘤生长的微环境。③自噬通量过大时引发肿瘤细胞的自噬性死亡[6]。

自噬保护正常细胞，同理也保护肿瘤细胞：①自噬为代谢需求提高的晚期肿瘤细胞提供营养，促进细胞存活。②内皮细胞的自噬有助缺氧环境中肿瘤血管的生成，加速肿瘤生长和转移[7]。③自噬可削弱免疫细胞对肿瘤的杀伤力，导致肿瘤免疫逃逸[8]。④某些癌基因（如RAS）驱动的肿瘤存在一定自噬依赖性。自噬对肿瘤的作用取决于肿瘤类型、阶段、遗传性质和自噬水平等多方面因素[9]。

自噬对HCC的调控也呈两面性：可抑制HCC，如自噬相关蛋白Beclin-1的表达水平与HCC等级成负相关[10]；ATG5缺陷的小鼠仅产生肝脏肿瘤[11]；也可促进HCC，如在晚期肝癌中检测到自噬增加，且与患者的低存活率密切相关[12]。由此观之，自噬在HCC中有特殊的地位，可能与肝脏代谢较快，对自噬有一定依赖有关。因此，选择自噬作为HCC的治疗靶点有广阔前景，研究中医药对HCC细胞自噬的调控有实在意义。

3 中药活性成分诱导HCC细胞自噬

中医药治疗肿瘤历史悠久，主要机制即诱导细胞死亡，包括细胞凋亡、细胞自噬、细胞坏死等[13]。近年诸多研究报道了多种抗癌中药成分具有自噬调控作用，相对于自噬对肿瘤的双面调控，这些中药活性成分的作用也可分为杀伤和保护两类。

3.1 自噬发挥杀伤作用

木犀草素（luteolin）是一种天然类黄酮化合物，存在于金银花、菊花等中药中，具有抗菌、调节免疫、抗氧化等效用[14]。木犀草素以浓度依赖方式诱导HCC细胞株HepG2内ROS的增加，并诱导自噬[15]。Cao等[16]发现木犀草素抗HCC细胞株SMMC-7721增殖，提高胞内自噬体数量，自噬蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，Beclin-1表达增加，自噬抑制剂氯喹干预后凋亡减少，表明木犀草素诱导的自噬促进凋亡。

紫草多糖是紫草的一种水溶性提取物，具有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤等作用。陈奇等[17]的研究显示紫草多糖显著降低H22肝癌荷瘤小鼠的瘤质量系数，抑瘤率达34.7%，且显著上调瘤组织中自噬相关基因ATG5、Beclin-1和LC3的表达，提示紫草多糖可能通过促进自噬抑制瘤体生长。

龙葵具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝等作用[18]。单独使用龙葵水提取物对HepG2及Hep5J细胞即有抗增殖活性，同顺铂或阿霉素联用能增强两种化疗药的毒性，同时观察到LC3-Ⅱ的聚集，说明龙葵引导的化疗增敏可能与其诱导自噬相关[19]。

苦参碱（murine）是苦参的主要活性成分，具有抗病毒、抗过敏和抗肿瘤等作用[20]。Yang等[21]发现，苦参碱抑制活体内肝癌MHCC97L移植瘤生长，促进MHCC97L和Huh-7细胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1和PI3KC3的上调及自噬底物p62的下调，提示苦参碱通过驱动自噬限制瘤体增长。

小檗碱（berberine）是存在于黄连和黄柏中的一种异喹啉生物碱，能抗炎、抗癌、降血糖[22-24]。Yu等[25]发现小檗碱通过活化AMPK诱导HepG2细胞自噬性死亡，敲除自噬相关基因或干扰AMPK后，细胞死亡率显著下降，而使用AMPK激活剂后细胞死亡率上升。

丹酚酸B（salvianolic acid B）是丹参的主要水溶活性成分，它诱导SK-Hep-1及Bel-7404细胞的凋亡和AKT/mTOR通道依赖性自噬。电镜下观察到广泛的自噬体结构，免疫荧光观察到LC3点的数量增多。阻断自噬后细胞凋亡率降低，说明丹酚酸B诱导的自噬加强凋亡[26]。

麦冬皂苷B抑制HepG2细胞增殖，流式细胞术显示其并不影响细胞周期和凋亡，吖啶橙染色及GFP-LC3质粒转染实验均提示自噬囊泡增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化、Beclin-1表达提高，自噬抑制剂3-MA几乎完全逆转自噬及细胞毒作用，提示麦冬皂苷主要通过诱导自噬性死亡抗癌[27]。

小白菊内酯是艾菊的主要活性成分，有抗炎、抗癌、抗动脉粥样硬化等作用[28]。刘战培等[29]发现小白菊内酯抑制SMMC-7721细胞增殖，吖啶橙染色见自噬泡阳性细胞数增加，LC3表达增加，p62底物减少，用NH4CL抑制自噬底物降解后细胞中LC3表达增加，说明小白菊内酯加强了自噬流。阻滞ROS使自噬流显著下降，说明ROS参与了小白菊内酯导致的自噬性死亡。

川芎嗪（ligustrazine）除了应用于心脑血管外也被发现有抗癌作用。Cao等[30]发现川芎嗪引起HepG2细胞自噬，在体、内外实验中均抑制肿瘤生长。进一步研究发现自噬由ROS介导产生，抑制自噬或ROS均减弱其抗癌效果，证明川芎嗪诱导的自噬呈杀伤性。

3.2 自噬发挥保护作用

蟾毒灵（bufalin）是从蟾酥中提取的成分，具有抗癌、强心和增强免疫等药理作用。研究发现在Huh-7和HepG2细胞中，蟾毒灵激活JNK通路，诱导内质网应激，进而激活自噬，阻断自噬后凋亡增强，说明蟾毒灵诱导保护性自噬，与其诱导的凋亡相拮抗[31]。

黄芩素（baicalin）是从黄芩中分离出的植物雌激素样物质，Wang等[32]发现黄芩素以剂量和时间依赖方式诱导SMMC-7721和BEL-7402細胞自噬，敲除ATG5和Beclin-1两个自噬基因后，细胞凋亡率升高，说明黄芩素发挥保护作用。

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）凭借高度的肝细胞亲和力，广泛应用于肝细胞靶向给药系统，它能降低肝癌细胞的活力，诱导凋亡和自噬[33]。GA激活ERK通路诱导自噬，使用药理方法或阻断ERK通路抑制自噬后，细胞活力进一步下降，凋亡蛋白增加，说明这种自噬是保护性的，会削弱GA或其所修饰纳米粒子所载化疗药之疗效[34]。

褐藻素（fucoxanthin）为昆布的有效成分之一，廖政邦等[35]的实验发现，褐藻素诱导HepG2细胞自噬和凋亡，表现为Beclin-1、LC3蛋白增加及自噬溶酶体的形成，Akt的活化受抑制。3-MA干预提高凋亡率并促进caspase-3活化，提示褐藻素可能通过抑制Akt通路诱导保护性自噬。

姜黄素（curcumin）是从姜黄、郁金、莪术等中药中提取的一种酸性酚类物质，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用。姜黄素诱导SMMC-7721细胞凋亡的同时还通过抑制Akt/mTOR诱导自噬，抑制自噬能增强其细胞毒力。这提示我们，诱导保护性自噬的药物需与自噬抑制剂同用才能发挥更好的疗效[36]。

桔梗皂苷-D（platycodin-D）是桔梗总皂苷的主要成分，有镇痛、抗炎、免疫调节等作用。桔梗皂苷-D诱导BEL-7402和HepG2细胞凋亡和自噬，可见胞质空泡形成、LC3-Ⅱ表达增加和MDC染色阳性细胞数增加。阻断自噬或ERK和JNK途径后，凋亡明显增强，小鼠异位移植瘤体积缩小，说明桔梗皂苷-D诱导保护性自噬，且与ERK和JNK途径的激活相关[37-38]。

β-榄香烯（β-elemene）存在于郁金和莪术中，它抑制HepG2细胞增殖并诱导自噬，并可使HepG2免受无血清饥饿诱导的凋亡。在小鼠H22实体瘤模型中，β-榄香烯以剂量依赖性降低阿帕替尼的效力，阻断自噬后细胞凋亡明显升高，说明其诱导的自噬抵消了部分细胞凋亡，使疗效大打折扣[39]。

葫芦素B（cucurbitacin B）是瓜蒂的提取物，有广泛的抗癌作用。Niu等[40]发现，葫芦素B能抑制BEL-7402细胞增殖，通过ROS介导细胞DNA损伤、凋亡和自噬，MDC染色、LC3-Ⅱ的上调、ULK1和AKT/mTOR的磷酸化证实了自噬的发生。下调PTEN阻断自噬后凋亡增强，提示PTEN参与了葫芦素B诱导的保护性自噬。

4 总结与展望

自噬影响肿瘤的形成、增殖、治疗反应与转移等方面，是肿瘤发病的核心机制之一，它扮演着复杂的角色。在健康细胞中，自噬清除ROS和炎症防止恶变，这是其质控功能的体现；在肿瘤细胞中，自噬通过营养循环支持肿瘤生长，这是其作为生存机制的体现。自噬或直接起作用，或与凋亡、坏死、炎症等其他细胞通路联系，共同决定肿瘤的命运。中药对肿瘤自噬的调控纷繁复杂，即使同一中药单体对不同肿瘤类型可有相反的自噬效应。中药调控自噬的研究仍处于初级阶段，明确特定条件下自噬的分子机制是自噬靶向药研发的理论基础。

诱导肿瘤细胞自噬性死亡是一条可行的抗肿瘤途径，需注意的是，正常细胞有一个平稳的自噬水平，靶向自噬的治疗中，对具体信号分子的选择是关键，要减少对正常细胞自噬的影响。另外，诱导凋亡是许多抗癌药物的共同机制，自噬与凋亡间有丰富的交叉网，一些药物诱导的保护性自噬会削弱凋亡，抑制这些自噬可减轻治疗抵抗。相比中药单体，中药复方有更全面的疗效也更贴近临床，但目前对复方的研究尚少，可通过血清药理学方法开展更多复方研究。中医药经自噬调节治疗肿瘤有广阔应用前景，充分研究后投入临床定能造福广大患者。

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（收稿日期：2018-03-26 本文編辑：封 华）