慢性肾脏病湿热型体质易感人群ICAM1基因和IL-10基因启动子多态性研究*

张海林 ，卢晓君 ，冯流畅 ，周珊珊 ，郑小丰 ，王子燕 ，韦芳宁

1广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2深圳市龙岗区中医院；3广东省中医院

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是世界性公共健康问题，国内患病率高达5.4%～14.4%。最终发展为终末期肾病，给社会和家庭带来沉重负担，早期对慢性肾脏病防治显得尤为重要，特别是从改变体质开始［1］。体质在许多情况下决定着机体对某些疾病的易患性和病变过程的倾向性。莫润田等［2］对岭南地区3 000名人群进行调查，结果提示湿热质1 188例，占39.6%，说明湿热质是长期在本地区居住人群的主要的偏颇体质。湿热体质形成后，在致病因素的诱发下，容易形成不同疾病中的湿热证，严重威胁人体的健康。湿热证涉及中医脏腑、经络7个系统的43种疾病，分属于西医的呼吸、泌尿等11个系统的72种急慢性疾病［2］。由此可见湿热质人群对多种疾病有易患性，而细胞黏附分子-1属于细胞黏附分子免疫球蛋白超家族成员，具有参与调节免疫反应、介导白细胞与内皮细胞及细胞外基质间黏附等作用；白细胞介素10(IL-10)是一种抑制性细胞因子，具有抑制促炎因子产生、抑制Th1细胞应答等作用，目前已有研究证实ICAM1、IL-10与多种疾病发生发展有关。笔者对岭南地区湿热型体质与CKD1期患者的ICAM1基因和IL-10基因启动子的多态性进行了探讨，旨在基于基因水平上客观认识湿热质及慢性肾脏病的关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年5月至2016年1月在广东省中医院住院及门诊就诊的106例CKD1期患者，按体质分为CKD1期湿热质组50例和CKD1期平和质组56例；选择102例健康体检者，随机分为健康湿热质组41例和健康平和质组61例。CKD1期湿热质组中男21例，女29例，平均年龄(44.98±18.14)岁。CKD1期平和质组中男19例，女37例，平均年龄(41.71±17.6)岁。健康湿热质组中男27例，女14例，平均年龄(35.44±12.28)岁。健康平和质组中男31例，女30例，平均年龄(33.64±9.76)岁。4组基本资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 纳入标准 纳入：1)符合慢性肾脏病的定义及分期［3］者；2)符合王琦的《中医体质学》［4］中湿热质、平和质标准。

1.3 排除标准 排除：1)排除高血压病、糖尿病、高脂血症、心脑血管疾病者；2)严重肝肾疾病、肿瘤等疾病者。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 所有受试对象早晨空腹抽取静脉血6 mL，EDTA抗凝管3 mL，采用天根生化有限公司血液基因组试剂盒，提取抗凝全血基因组DNA，严格按照说明书操作步骤进行。无抗凝管3mL，在2小时内3 000 rpm离心10分钟后取上清液，用于ELISA实验检测ICAM1、IL-10血清浓度。提取后的血清及抗凝管在-80℃保存备用。

1.4.2 引物设计 引物均由上海生工公司设计共 3 对：ICAM1 基因 K469F：5′-CCCATAAGGTCTTGCCTCCA-3′，ICAM1 基 K469R:5′-CACCAATATGGGAAGGCCGA-3′；ICAM1 基因 G241F：5′-GATTGAAGAAGCCAGCAG-3′，ICAM1 基因 G241R:5′-GTCGTTGCCATAGGTGAC-3′；IL-10-F：5′-TGGCTCCCCTTACCTTCTAC-3′，IL-10-R:5′-GTCTCTGGGCCTTAGTTTCC-3′。

1.4.3 PCR扩增及基因型分析 总反应体系为25 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL，dNTP0.5μL，Tag Butter2.5μL，Taq酶1U，水20μL。反应条件：94℃预热 30 min，94℃变性 30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环变性、退火、延伸30次，72℃延伸3分钟，4℃保存30分钟。取1%琼脂糖0.8 g，加0.5×TBE缓冲液，加热溶解后冷却至 60℃，加 10 mg/mL溴化乙锭 3 μL，取 5 μL PCR 产物与 1 μL6×Loading Buffer 混合加样，并用5 μL 100 bp ladder作为参照，在120 V下电泳30分钟，在凝胶成像仪上拍照保存见图1。验证扩增产物为目的片段后，由上海生工生物公司完成测序。

图1 1%琼脂糖电泳图(IL-10)

1.5 统计学方法 所有数据采用SPSS 20.0统计学软件分析，4组间基因型分布及基因频率为计数资料，采用χ2检验，非正态分布的定量资料，采用秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-10基因及ICAM1基因多态性分析 4组IL-10 基因启动子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位点基因型分布及基因频率比较差异无统计学意义(P＞0.05)；4组ICAM1基因G241(G/R)和K469(G/A)位点基因型分布及基因频率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1-5。

2.2 ICAM1、IL-10血清浓度 4组间ICAM1血清浓度比较，差异有统计学差异(P＜0.05)，4组间IL-10血清浓度比较，差异无统计学差异(P＞0.05)。见表6-7。

表1 各组ICAM-1 G241位点基因型及基因频率分布比较

表2 各组ICAM-1 K469位点基因型及基因频率分布

表3 各组IL-10-592位点基因型及基因频率分布

表4 各组IL-10-819位点基因型及基因频率分布

表5 各组IL-10-1082位点基因型及基因频率分布

表6 各组ICAM-1血清浓度分布 μg/L

表7 各组IL-10血清浓度分布 μg/L

2.3 不同基因型的ICAM浓度 CKD1期患者中83例含ICAM1 G241位点GG基因型ICAM1期浓度(534529.2±748916.9)μg/L，CKD1 患者中 31例含ICAM1 G241位点GR基因型ICAM1浓度(834794.8±735658.3)μg/L。健康人中65例含ICAM1 G241位点GG基因型 ICAM1浓度(382 891.9±687 828.4)μg/L，健康人中25例含ICAM1 G241位点GR基因型ICAM1 浓度(543 928.9±482 480.1)μg/L，经秩和检验，P=0.003，含有G241位点GG基因型血清ICAM1浓度显著比含有GR基因型低 (P＜0.05)。CKD1患者中47例含ICAM1 K469位点AG基因型ICAM1浓度(801757.4±981182.3)μg/L，CKD1 患者中6例含ICAM1 K469位点GG基因型ICAM1浓度(882 012.6±519-30.0)μg/L，CKD1 患者中 49例含 ICAM1 K469位点AA基因型 ICAM1浓度(507 561.5±501 763.5)μg/L。健康人中 55例含ICAM1 K469位点AA基因型ICAM1浓度478 901.6±685809.4)μg/L，健康人中 44 例含ICAM1 K469位点AG基因型ICAM1浓度(307 328.9±535061.7)μg/L，健康人中2例含ICAM1 K469位点GG基因型ICAM1浓度(135 761.0±191 361.4)μg/L。在CKD1期患者中含有K469位点不同基因型血清ICAM1浓度差异无统计学意义(P＞0.05)；在健康人中含有K469位点不同基因型血清ICAM1浓度差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

ICAM-1是存在于多种细胞表面的诱导性糖蛋白，致炎因子、感染、应激等主要通过激活ICAM-1基因的转录，增加在炎症性疾病中的表达［3-5］。目前相关研究证实，ICAM-1基因表达与多种疾病相关，但未考虑体质因素，本研究探讨了ICAM-1基因多态性与CKD和湿热质的相关性。路方红等［5］研究发现，中国汉族人群存在ICAM-1 K469基因多态性，其中K基因有可能是冠心病遗传危险因素。蒋辉华等［6］研究发现，汉族人脑梗死面积不同也与ICAM-1指标相关，E等位基因可能是影响汉族人脑梗死的等位基因。姜玉姬等［7］研究结果证实ICAM-1参与IgA肾病的进展，肾小管间质ICAM-1的表达可能与IgA肾病进行性损伤有关。本研究中4组ICAM1基因G241(G/R)和K469(G/A)位点基因型分布及基因频率差异无统计学意义，提示未发现湿热质CKD1期患者ICAM-1 K469、G241基因多态性，但研究结果提示4组ICAM-1血清浓度有明显统计学差异，且CKD1期湿热质ICAM-1 血清浓度(699 653.80±856 250.14)μg/L最高，CKD1期平和质ICAM-1血清浓度(635 662.87±697 397.60)μg/L次之，说明ICAM-1血清浓度与CKD1期湿热质相关，而ICAM-1与炎症反应相关，为湿热体质人群对慢性肾脏病易感性提供客观依据，且含有G241位点GG基因型血清ICAM1浓度显著比含有GR基因型低。进一步说明ICAM-1 G241位点GG基因型可能是慢性肾脏病、湿热质预测基因。且通过G241位点GG基因型调控ICAM1，使得ICAM1的表达下调，血清ICAM1浓度降低，减少炎症反应。IL-10主要有抑制多种促炎因子产生，抑制巨噬细胞抗原提升功能，抑制Th1细胞应答等作用。目前有研究证实,IL-10启动子区不同位点与多种疾病有相关性。

吴绍燕等［8］研究发现胃癌患者与幽门螺旋杆菌感染者存在IL-10-592位点多态性，说明IL-10-592基因是幽门螺旋杆菌相关性胃癌的易感基因。朱丽晶等［9］发现IL-10基因-592A/C多态性在正常人群与LN患者分布无显著差异，但是IL-10基因多态性与LN活动性相关。吴红赤等［10］发现，正常人及终末期肾病患者IL-10-1082A/G基因型分布及基因频率无统计学差异，但是IL-10-1082A/A基因型患者IL-10水平显著低于A/G、G/G基因型。本研究与前两者研究结果一致，狼疮性肾病、终末期肾病均属于慢性肾脏病。本研究中4组IL-10基因启动子-1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位点基因型分布及基因频率无统计学差异，且4组间IL-10浓度无统计学差异。该研究说明4组人群中不存在IL-10 基因启动子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位点基因多态性，IL-10浓度可能不受IL-10 基因启动子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)调控。

综上所述，湿热质人群是慢性肾脏病的易感人群，ICAM-1 G241位点GG基因型与慢性肾脏病、湿热质有着密切的关系。G241位点GG基因型是慢性肾脏病保护基因，该基因调控ICAM1，使得ICAM1的表达下调，血清ICAM1浓度降低，减少炎症反应。提示通过调整ICAM-1的表达，可以纠正体质，特别是体质的偏颇状态，达到预防或减少慢性肾脏病发生或发展的目的。