莫诺苷对脑缺血再灌注大鼠海马细胞周期蛋白表达的影响*

刘婷婷 许栋明 孙芳玲 郑文荣 祝自新 田 欣 郭德玉 王 文

(1.首都医科大学宣武医院实验动物室，北京市老年病医疗研究中心，北京 100053) (2. 科技部火炬高技术产业开发中心，北京 100038)

缺血性脑卒中是一种严重的神经系统疾病，是导致残疾和死亡的主要原因之一[1]。很多信号通路参与调节缺血性脑卒中的病理生理过程，细胞周期相关蛋白的异常激活是缺血性脑损伤后的重要调控机制，其与神经细胞的凋亡密切相关，是调控缺血后神经细胞死亡的一个重要因素[2]。在细胞正常分裂时，细胞周期相关蛋白的激活可以促进细胞分裂增殖，但许多疾病中，病理刺激导致细胞周期调控机制紊乱，细胞周期相关蛋白异常激活，使处于分化末期的部分神经细胞再次进入细胞周期，最终导致细胞死亡。很多蛋白参与调控细胞周期的过程，其中包括cyclins、cyclin激活酶(cyclin-activated kinases, CDKs)、cyclin激酶抑制剂CDKIs(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKIs)等。细胞周期激活以后D型cyclins合成，其与CDK6结合后促进细胞从G0进入G1期，该过程为进入细胞周期的起始，也是调控细胞周期的关键。有研究表明，通过降低D型cyclins及其激酶，抑制细胞由G0进入G1期，可以减少大脑缺血性损伤导致的神经细胞凋亡[3]。通过抑制缺血性脑损伤后细胞周期相关蛋白的异常激活，可以起到神经保护的作用。

莫诺苷是从中药山茱萸中提取的一种单体化合物，我们前期研究结果发现，其对缺血性脑卒中损伤大鼠有抗炎、抗凋亡、改善大鼠神经功能的作用[4-5]。在前期研究基础上，本试验用蛋白免疫印迹的方法进一步研究莫诺苷是否可以调节缺血性脑卒中大鼠患侧海马CyclinD1、CDK6的蛋白表达情况，从而发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：成年雄性 Sprague-Dawley大鼠，体质量260～280 g，SPF级，合格证编号：SYXK(京)2017-0033， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2实验试剂及药品：CyclinD1小鼠单克隆一抗(WH0001019M3)，CDK6小鼠单克隆一抗(WH000102M1)购自美国Sigma公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)购自北京市中杉金桥生物技术有限公司。RIPA 裂解液(P0013B)购自碧云天生物技术研究所。BCA法蛋白定量试剂盒(P1511)购自北京普利莱基因技术有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)购自美国 THERMO-PIERCE公司。莫诺苷由首都医科大学宣武医院实验动物室从中药山茱萸中提取，HPLC分析纯度大于98.5%。

1.2 方法

1.2.1大鼠MCAO模型制作及分组：大鼠经适应性喂养后，采用改良Zea Longa线栓法[6-7]制备局灶性脑缺血再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛 3.5 mL/kg进行麻醉，将直径为0.26 mm的尼龙线从右颈总动脉插入颈内动脉，至距颈外动脉和颈内动脉分叉处约 1.8 cm时，会有阻挡感，说明栓线已越过大脑中动脉，到达大脑前动脉的起始部。栓塞30 min后，拔出尼龙线。假手术组除不插入尼龙线外其他操作与手术组相同。根据5分制评分方法，剔除模型不成功的大鼠后，随机分为5组：假手术组，模型组，莫诺苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、 大(270 mg/kg)剂 量 组。术后连续灌胃给药 7 d，每天给药 1 次，其中假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

1.2.2Western blot分析：术后 7 d，大鼠 10%水合氯醛 3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉。迅速剥离大脑并将脑膜剥去，取出患侧海马包入锡箔纸中，放入液氮中冻存片刻，-80 ℃保存。取患侧海马于 5 mL EP 管中称重，加入预冷的裂解液 7 μL/mg组织、PMSF 1 μL/100 μL RIPA，冰上充分超声粉碎。4 ℃静止 30 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min。取上清测定蛋白浓度，总蛋白与 5×上样缓冲液 1∶4稀释，95 ℃变性10 min。

采用 10% SDS-PAGE 分离胶，浓缩胶用 5% SDS-PAGE。电泳：浓缩胶电压60 V，40 min，分离胶电压90 V，90 min，分离蛋白。电泳后用 0.45 μm NC 膜进行转膜；条带在 5%脱脂奶粉中封闭 2 h；分别用小鼠单克隆CyclinD1 抗体(1∶1000)、小鼠单克隆CDK6抗体(1∶1000)和小鼠单克隆β-actin 抗体(1∶1000)，4 ℃冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min。加相应辣根过氧化物酶结合二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤 3次，每次 10 min；ECL显色1 min，滤去显色液，凝胶成像仪拍片。用Quanity One软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 莫诺苷对患侧海马CyclinD1蛋白表达的影响

用Western blot 的方法检测局灶性脑缺血大鼠患侧海马CyclinD1蛋白表达的情况。如图1所示，与假手术组相比，模型组患侧海马组织CyclinD1蛋白表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，莫诺苷中剂量组与大剂量组患侧海马组织CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05;P<0.05)；莫诺苷小剂量组患侧海马组织CyclinD1表达有降低的趋势，但无统计学差异。

图1 各组患侧海马组织CyclinD1蛋白表达情况注：#P<0.05与假手术组相比，*P<0.05与模型组相比Fig.1 The expression of CyclinD1 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

2.2 莫诺苷对患侧海马CDK6蛋白表达的影响

用Western blot 的方法检测局灶性脑缺血大鼠患侧海马CDK6蛋白表达的情况。如图2所示，与假手术组相比，模型组患侧海马组织CDK6蛋白表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，莫诺苷中剂量组与大剂量组患侧海马组织CDK6蛋白表达显著降低(P<0.05;P<0.05)；莫诺苷小剂量组患侧海马组织CDK6表达有降低的趋势，但无统计学差异。

图2 各组患侧海马组织CDK6蛋白表达情况注：#P<0.05与假手术组相比，*P<0.05与模型组相比Fig.2 The expression of CDK6 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

3 讨论

细胞周期是非常复杂而微妙的过程，细胞进入正常的细胞周期则进行正常的细胞分裂，而细胞进入异常的细胞周期则激活凋亡信号导致细胞死亡[8-9]。近期研究表明，在急性和慢性神经退行性疾病中，细胞周期信号通路参与调控神经细胞的死亡[10-11]。动物实验和细胞实验都证明，细胞周期的异常激活可以诱导caspase依赖的神经元凋亡[12-13]。Chai等研究显示，小檗碱可以抑制细胞周期蛋白CyclinD1的表达而抑制细胞凋亡[3]。此外，我们前期用免疫组化的方法检测患侧海马细胞周期蛋白的表达，结果发现莫诺苷的神经保护作用很有可能与其可以降低缺血性脑卒中大鼠患侧海马CA1区CyclinD1与CDK6的阳性细胞有关[14]。在该研究中我们用蛋白免疫印迹的方法，检测局灶性脑缺血再灌注大鼠给药7 d后患侧海马组织CyclinD1与CDK6的表达情况，进一步验证了我们之前的研究结论。与前期研究结果一致，模型组与假手术组相比，CyclinD1及CDK6的表达显著增加，导致缺血性脑损伤后进入异常细胞周期的细胞增多，与Wen等研究一致[15]，进而导致神经细胞凋亡增加。给予莫诺苷后，与模型组相比，CyclinD1与CDK6的表达显著降低，与前期研究结果一致，表明莫诺苷可以起到抑制脑缺血导致的CyclinD1和CDK6过量表达，从而抑制神经细胞进入异常细胞周期，发挥神经保护作用。

综上所述，缺血性脑损伤会使细胞周期相关蛋白异常激活，导致分化末期的神经细胞再次进入细胞周期，该过程可以导致神经细胞的凋亡。通过药物抑制细胞周期相关蛋白异常激活，阻止细胞进入异常的细胞周期很可能成为脑卒中的一个潜在治疗靶点。