花青素对完全弗氏佐剂诱导慢性炎性痛的镇痛作用及其机制*

王 静， 陈泽峰， 和春霞， 王莉莉， 郑嘉慧， 张 皓， 王占磊， 鲁亚平

(1. 皖南医学院基础医学院生理学教研室， 2. 皖南医学院2013级临床专业， 3. 皖南医学院2015级临床专业， 4. 皖南医学院2014级麻醉专业, 安徽 芜湖 241002； 5. 安徽师范大学生命科学学院, 安徽 芜湖 241002)

慢性痛已成为影响人类劳动能力和生存质量的最普通、最直接的因素，但关于慢性痛的机制尚不十分明确，天然而副作用小的镇痛药物也有待开发。研究证实，瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type1， TRPV1)同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调控，在慢性炎性痛中具有重要作用[1,2]。

花青素是一类广泛存在于高等植物的果实、花、茎等器官中的黄酮类化合物，已有研究发现花青素具有抗氧化、抗炎镇痛、抑菌、抗衰老、抗癌作用以及对肝脏、心脑血管和视力的保护作用[3-5]。本课题组前期研究结果已证实花青素具有抗炎镇痛作用，金叶女贞果实花青素能抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，抑制棉球所致肉芽肿增生，提高小鼠热痛阈，降低醋酸致小鼠扭体次数，其抗炎镇痛机制与增强小鼠抗氧化能力和降低炎性因子NO和PGE2生成有关[6,7]。

炎性痛模型有：福尔马林炎性痛模型，弗氏佐剂炎性痛模型(分为多发性佐剂炎性痛模型和单发性佐剂炎性痛模型)，角叉菜胶炎性痛模型，蜂蜜毒炎性痛模型，松节油炎性痛模型。福尔马林模型和角叉菜胶模型常用于急性和亚急性炎症模型。弗氏佐剂、蜂蜜毒、松节油常用于诱导慢性炎性痛模型，蜂蜜毒诱导的炎性痛呈现多种疼痛表现型，多发性弗氏佐剂诱导的模型病变范围较广，涉及多器官系统免疫性病变，适合于进行抗类风湿的药物研究和自身免疫性疾病的研究。单发性佐剂炎性痛模型克服了多发性佐剂关节炎模型的缺点，将弗氏佐剂注入足底皮下而非足内，造成局部组织周围炎症，痛觉过敏持续2～3周，是目前最常用的经典慢性炎性痛模型[8]。本研究拟用单发性佐剂炎性痛模型(完全弗氏佐剂)诱导经典慢性炎性痛大鼠模型，观察花青素对慢性炎性痛大鼠的镇痛作用，分析其对慢性炎性痛大鼠炎性因子的释放及中枢海马区TRPV1表达的影响，试图阐明金叶女贞果实花青素抗炎镇痛作用可能的中枢机制，为镇痛中药的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)20080033。30只大鼠随机分为三组(n=10)：(1)生理盐水对照组(normal saline control group, NS), 左后肢足底注射生理盐水100 μl；(2)慢性炎性痛模型组(chronic inflammatory pain model, Mod)，左后肢足底中部注射完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant, CFA)100 μl复制慢性炎性痛模型；(3)花青素治疗组(anthocyanin treatment, Ant)，左后肢足底注射CFA 100 μl，同天开始灌胃给药花青素(纯花青素粉末用生理盐水配制，根据前期实验结果确定给药浓度90 mg·kg-1)连续给药14 d。

1.2 主要仪器与试剂

PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司)，BW-YLS-3E 电子压痛仪(上海软隆科技)，YLS-7B足趾容积测量仪(上海软隆科技)，UV-3200PCS紫外分光光度计(上海美谱达仪器)，Model-680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)。完全弗氏佐剂(sigma)。

1.3 花青素的提取与纯化

金叶女贞果实经筛选、清洗后置于烘箱中，50℃烘干至恒重，粉碎过80目筛，加75%的乙醇(料液比1∶15)经微波化学反应器提取，提取液抽滤去除滤渣得粗提液。粗提液经DM130大孔树脂柱吸附，吸附完全后，以大量的蒸馏水冲柱去糖，再经石油醚萃取去脂类，得到去糖去脂花青素，最后置于冻干机中冻干，得到纯花青素粉末，使用时用生理盐水配置的花青素溶液。

1.4 慢性炎性痛模型建立

完全弗氏佐剂(complete Freund’S adjuvant，CFA)是一种常用的致炎剂，能够造成注射局部炎症，从而引起伤害性反应，是建立慢性炎症痛模型最常用的药物。具体操作：消毒大鼠左侧后肢及足底，经足底皮下注射CFA100 μl，注射后按压数分钟，促进药物吸收。造模成功标准依据文献[9]判定。

1.5 行为学观察

1.5.1 大鼠体重监测 实验开始前(记作T0)和术后第1、3、5——13日(记作T1、T3、T5——T13)相同时间点测量各组大鼠体重。

1.5.2 足趾容积测量 用足趾容积测量仪在实验开始前(T0)和术后第1、3、5——13日(T1、T3、T5——T13)相同时间点测量大鼠左侧后足趾容积。

1.5.3 热痛阈值检测 清醒大鼠放入测试箱中，室温、安静状态下热刺痛仪热光源分别照射大鼠左足底部，当大鼠出现抬足、舔脚反应时的时间为热痛阈(Heat pain threshold，HPT)。当时间达到30 s，而大鼠仍无反应时便停止照射，以免损伤皮肤，并以30 s作为最高痛阈。痛阈测定时每组循环测定3次，两次时间间隔大于5 min，取3次的平均值作为HPT。各组大鼠均于CFA术前、术后第1、3、5、——13日测定HPT。

1.5.4 机械痛阈值检测 清醒大鼠在室温、安静状态下,将左侧后肢足背部置于压痛仪硅板上，并在足背部皮肤做一标记，脚踩踏板增加压爪强度，当大鼠出现缩腿、挣扎、嘶叫时，踩下踏板，此时压强为机械压痛阈值(mechanical pain threshold, MPT)。当压力达到250 g，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤，并以250 g作为最高痛阈。痛阈测定时每组循环测定3次，2次时间间隔大于5 min，取3次的平均值作为MPT。各组大鼠均于CFA术前、术后第1、3、5——13日测定MPT。

1.6 检测方法

术后第14日实验结束，取动物血清，比色法测定血清SOD、NO、MDA和PGE2含量，具体方法按试剂盒说明进行。另取海马区组织迅速置于液氮中保存，使用前冰上解冻组织，按照每10 mg组织加入100 μl裂解液的比例加入加RIPA裂解液。用超声破碎仪在冰上进行超声匀浆，直至充分裂解，然后12 000 r/min离心20 min，取上清按一定比例与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，冰上迅速冷却后-20℃储存。Western blot实验取样品20 μl经SDS-PAGE→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显影→洗脱→拍照→条带分析。分析海马区p-TRPV1和TRPV1蛋白的表达。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 花青素对慢性炎性痛大鼠体重的影响

表1显示三组大鼠体重在实验的两周内均呈缓慢增长趋势，各组间没有明显差异。

2.2 花青素对慢性炎性痛大鼠足趾容积的影响

表2显示：与NS相比，Mod组和Ant组在术后第1日，足趾容积明显增大(P<0.05), 术后第3日足趾肿胀最明显(P<0.01)，随后足趾肿胀度逐渐缓解，但与NS组相比一直有明显差异(P<0.01)； 在术后第7日，Ant组足趾容积显著低于Mod组(P<0.05)。

2.3 模型组大鼠左后侧足趾肿胀度监测

图1显示的是NS，Mod，Ant三组大鼠在术后第1、5、9、13日后肢足趾照片。NS组大鼠左后足趾没有出现肿胀；Mod组大鼠左后足趾明显出现肿胀并一直持续14 d；Ant组大鼠左后足趾也出现明显肿胀，但后期逐渐缓解，具体各组大鼠左后足趾容积见表2。

2.4 花青素对慢性炎性痛大鼠热痛阈的影响

表3显示各组在术前热痛阈值没有明显差异，与NS组相比，术后第3日Mod组和Ant组热痛阈值降低最为显著(P<0.01)，随后热痛阈缓慢上升，术后第7日，Ant组的热痛阈开始接近NS组，且Ant组的热痛阈明显高于Mod组(P<0.05)。

Fig.1Hind toes in each group after operation (T1，T5，T9，T13 mean 1，5，9，13 days after operation)

2.5 花青素对慢性炎性痛大鼠机械痛阈的影响

表4显示：与NS组比较，Mod组和Ant组大鼠机械痛阈值在术后第3日出现明显降低(P<0.01)，Mod组在术后第11日机械痛阈值有所缓解，Ant组在术后第7日机械痛阈值开始上升。在术后第9日，Ant组的机械痛阈值开始明显高于Mod组(P<0.05)。

2.6 花青素对慢性炎性痛大鼠血清生化指标的影响

表5显示，与NS组比较，Mod组大鼠血清中SOD水平降低(P<0.05)，MDA、NO和PGE2水平明显升高(P<0.01)；与Mod组比较，Ant组大鼠血清中SOD含量升高(P<0.01)，MDA、NO和PGE2含量有所降低(P<0.05)。

2.7 花青素对慢性炎性痛大鼠海马区TRPV1表达的影响

Western blot结果显示，与NS组比较，Mod组和Ant组大鼠海马区总TRPV1和p-TRPV1表达均显著提高(P<0.01，P<0.05)；与Mod组比较，Ant组大鼠海马区p-TRPV1表达降低(P<0.05，图2，表6)。

Fig.2Effects of anthocyanin on the expressions of TRPV1 and p-TRPV1 in hippocampus of rats with chronic inflammatory pain

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

Tab. 1 Effects of anthocyanin on body weight in rats with chronic inflammatory pain(g， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

Tab. 2 Effects of anthocyanin on toe volume in rats with chronic inflammatory pain(ml， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 3 Effects of anthocyanin on heat pain threshold in rats with chronic inflammatory pain(s， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 4 Effects of anthocyanin on mechanical pain threshold in rats with chronic inflammatory pain(g， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 5 Effects of anthocyanin on serum levels of SOD, MDA, NO and PGE2 in rats with chronic inflammatory n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05 ,##P<0.01vsMod group

GroupTRPV1p-TRPV1NS 11Mod2.86±0.02∗∗2.04±0.01∗∗Ant2.52±0.01∗∗1.42±0.01∗#

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

3 讨论

本研究中用到的花青素来自金叶女贞果实，金叶女贞是一种常见木犀科半绿小灌木，易栽培，果实产量高且含丰富的花青素，相比蓝莓，葡萄籽中花青素获得更加低廉便捷。本研究通过完全弗氏佐剂成功诱导经典的慢性炎性痛大鼠模型，且炎性痛持续14 d，经金叶女贞果实花青素溶液灌胃14 d，提高大鼠热痛阈和机械痛阈(P<0.05)，降低足趾肿胀度(P<0.05)，说明花青素对慢性炎性痛大鼠有镇痛作用。分析其机制可能与花青素提高大鼠抗氧化能力，减少炎性因子MDA、NO和PGE2的生成有关。SOD的作用是清除体内的氧自由基，减少自由基对细胞的破坏，可以反映自由基的损害程度[10]。NO通过促进血管舒张、形成水肿和增加炎性渗出从而促进炎症反应，同时NO作为中枢递质或第二信使可以直接或间接的激活TRPV通道，起到痛觉增敏效应[11,12]。内源性PGE2可诱导大鼠出现热痛觉过敏症状，溴烯醇内酯抑制 PGE2的合成，能够减轻角叉菜椒诱发的痛觉过敏。研究发现PGE2通过 EP1受体，磷酸化TRPV1，从而增强TRPV1的功能活性[13]。

疼痛的发生有外周痛觉感受器，感觉神经传入系统及多个脑区的共同参与，尤其是海马[14]。关于慢性痛机制的研究，主要围绕外周伤害性感受器和痛觉中枢两个水平展开。研究表明，TRPV1是位于细胞膜或细胞器膜上的一类非选择性阳离子通道,既存在于外周伤害性感受器又存在于痛觉中枢(海马，蓝斑，下丘脑)。TRPV1可被热(> 43℃)、酸(pH<5.9)、辣椒素等激活，引起阳离子Ca2+，Na+内流(PCa/Na≈10)，从而促进神经元的兴奋，参与痛觉信号的传递。局部炎症介质如缓激肽、前列腺素E2、神经生长因子和 ATP 等刺激可使TRPV1发生功能敏化，表现出激活阈值下降、通道电流增大和膜定位增多等现象[15-17]。TRPV1基因敲除小鼠对伤害性热刺激的反应性显著降低，尤其是炎症痛模型鼠的热痛觉敏化行为显著减弱[18,19]。Eid[20]等研究发现给大鼠口服TRPV1特异性阻断剂可降低动物对神经性疼痛的反应。TRPV1的激活是与配体结合引起片段的磷酸化而进一步活化，受体磷酸化增加不仅增强受体在细胞表面的稳定表达,而且增加通道开放的可能性。我们的结果显示，花青素降低中枢海马区p-TRPV1/TRPV1的比例，说明花青素降低足趾肿胀度，增强痛阈，可能与下调TRPV1的磷酸化水平有关。

本研究证实金叶女贞果实花青素对完全弗氏佐剂诱导的慢性炎性痛有镇痛消肿作用，分析其机制可能与金叶女贞果实花青素降低炎性因子的释放，增强抗氧化能力有关；同时金叶女贞果实花青素降低中枢海马区p-TRPV1/TRPV1的比例，说明花青素的镇痛作用可能与TRPV1的磷酸化水平有关，但是花青素是直接作用于TRPV1通道，还是通过炎性因子间接作用于TRPV1通道，我们将做深入研究。金叶女贞果实花青素作为一种廉价易得的高效抗氧化剂，如能明确其镇痛机制，将为无副作用的镇痛中药筛选提供有力的实验依据。