HMGB1、Notch1、PCNA 在宫颈癌组织的表达及临床意义

刘东伯 杨 丽 周洋媚 陈春丽

1．华中科技大学同济医学院附属同济医院( 武汉，430030) ;2．湖北省十堰市太和医院

近年来关于高迁移率族蛋白B1( HMGB1) 、人跨膜蛋白Notch1 和增殖细胞核抗原( PCNA) 的研究成为学术界的热门话题，多篇报道认为三者可能参与了恶性肿瘤细胞的增殖与转移过程［1-3］。然而目前关于3 种细胞因子表达相关性的研究较少，本研究对宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变( CIN) 及正常宫颈组织中上述3 种蛋白表达进行检测，探究其在不同组织间的表达差异、临床病理特征影响及与宫颈癌组织相关性。

1 资料和方法

1．1 研究对象

选取2015 年1 月—2018 年1 月于本院妇产科行全子宫或次全子宫切除术且病理为宫颈鳞癌的患者60 例( 宫颈癌组) ，患者住院期间无严重并发症，年龄( 49．6±5．2) 岁( 26～78 岁) ;TNM 分期为Ⅰ期19例、Ⅱ期21 例、Ⅲ期20 例; 肿瘤分化程度为低分化26 例，中分化28 例，高分化6 例。另取本院同期确诊为宫颈上皮内瘤变( CIN) Ⅲ期患者40 例( CIN组) ，年龄( 50．3±5．4) 岁( 24 ～77 岁) ;参加体检的健康志愿者20 例( 对照组) ，年龄( 50．8±5．6) 岁( 21 ～75 岁) 。3 组 年 龄 无 统 计 学 差 异( t = 2．435，P ＞0.05) ，具有可比性。本研究经院医学伦理委员会审批通过，患者及志愿者均对本次研究知情并签署同意书。

1．2 仪器及试剂

1．3 方法

取宫颈癌和CIN 两组病灶组织及对照组正常宫颈组织，经固定、脱水透蜡、包埋、切片烘干。于微波下采用枸橼酸盐缓冲液修复抗原，加入3%过氧化氢40min、灭活内源性酶，PBS 洗片3 次，滴加山羊血清封闭，时间30min。依次滴加兔抗人HMGB1抗体( 1:100) ，大鼠抗人Notch1( 1:100) 和PCNA 单克隆抗体( 1:100) ，抗体于4℃环境下过夜，甩除一抗，重复PBS 洗片3 次( 5min/次) ，滴加二抗( 1:100) ，室温下孵育30min，洗片后DAB 染色，脱水透明，封片，显微镜下观察结果。用宫颈鳞癌作HMGB1、Notch1 和PCNA 的阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。

1．4 显微镜观察标准

1．5 统计学方法

采用SPSS18．0 统计学软件进行数据处理分析。计量资料用( 珋x±s) 表示，组间比较应用独立样本t 检验。计数资料用百分率表示，采用检验; 分析HMGB1、Notch1 和PCNA 表达程度与临床病理特征的关系采用秩和检验;采用Spearman 法行相关性分析。以P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组宫颈组织蛋白表达情况比较

HMGB1、Notch1 和PCNA 均在细胞核中表达，表现为深褐色或棕黄色颗粒，且宫颈癌组阳性表达率最高，CIN 组次之，对照组最低( P 均＜0．05) 。见表1，图1～3。

图1 宫颈组织HMGB1 表达( ×400)

图2 宫颈组织Notch1 表达

图3 宫颈组织PCNA 表达( ×400)

2．2 宫颈癌组织中蛋白表达与临床病理特征关系

宫颈癌组不同年龄段患者宫颈组织中HMGB1、Notch1 和PCNA 表达无统计学差异，而分化程度低、TNM 分期高的组织中上述细胞因子的阳性表达程度相对较高( P 均＜0．05) 。见表2、3、4。

表2 宫颈癌组织中HMGB1 表达程度与临床病理特征比较［例(%)］

表3 宫颈癌组织中Notch1 表达程度与临床病理特征比较［例(%)］

表4 宫颈癌组织中PCNA 表达程度与临床病理特征比较［例(%)］

2．3 宫颈癌组织中3 种蛋白表达的相关性

对60 例宫颈鳞癌组织中HMGB1、Notch1 和PCNA 的表达情况行Spearman 相关性分析，3 者在宫颈鳞癌组织中的表达两两均呈正相关( P 均＜0．05) 。见表5。

表5 各蛋白在宫颈鳞癌中表达的相关性(例)

3 讨论

子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年发病呈年轻化趋势［5］。随着宫颈细胞学筛查的普及，癌前病变和宫颈癌得以在早期发现、诊断和治疗，其发病率和病死率也逐渐下降［6-7］。尽管如此，宫颈癌的病死率仍高达35%，其中绝大部分患者在早期未能通过筛查发现，最终死于恶性肿瘤转移，因此早期诊断对改善患者预后具有重要意义［8］。宫颈癌的发病过程较漫长，需要历经慢性炎症、非典型细胞增生、CIN 等阶段形成原位癌，在这个过程中，多种原癌基因和抑癌基因参与了调控［9］。近年来关于HMGB1、Notch1 和PCNA 的研究成为热点，HMGB1 可在凝胶电泳过程中快速迁移，被认为是重要的致炎细胞因子。此外有研究认为HMGB1 具有促进宫颈癌HeLa 细胞增殖、转移的作用［10］。Notch受体有4 个类型，Notch1 信号通路可维持细胞增殖、分化和凋亡三者间的平衡，当相应染色体发生易位后，可导致该蛋白的胞外区丢失，蛋白整体失去原有功能，胞内区因获取组成性活性而发挥致癌作用［11］。PCNA 是细胞核内合成的一种蛋白质，其含量的改变可反映DNA 的合成情况，因此可视为评价细胞增殖的指标［12-13］。目前关于三者在宫颈癌组织中表达的相关性报道较少，探究三者关系具有较高的临床意义。

从本次研究的结果来看，宫颈癌组HMGB1、Notch1 和PCNA 的阳性表达率均高于另外两组，而对照组最低，与张瑞青［14］研究结果一致，证实三者在宫颈癌形成过程中发生了变化。HMGB1、Notch1和PCNA 在宫颈癌中的表达与年龄无关，而与分化程度和TNM 分期有关，随分化程度下降和TNM 分期增加，表达程度提高。HMGB1、Notch1 和PCNA在表达上两两间均呈正相关。根据上述结果推断三者均参与了癌细胞的转移和浸润过程，同时三者互相起到协同作用，但具体协同机制需进一步探究［15］。本研究的主要不足为以下两点:①除正常宫颈和宫颈癌组织外，本研究仅选取了CIN Ⅲ期的患者，未来的观察中可纳入宫颈慢性炎症、不典型细胞增生和CIN Ⅰ～Ⅱ期的患者，以加强对结果的论证;②本研究限于病例数量，仅将临床上最常见的鳞癌纳入研究，因此上述结果是否适用于腺癌、腺鳞癌等类型的宫颈癌仍需进一步验证。

综上所述，与正常宫颈和CIN 组织相比，宫颈癌组织中HMGB1、Notch1 和PCNA 的表达显著提高，其表达程度随分化程度下降、TNM 分期增加而提高，提示3 种蛋白参与了宫颈癌的发生、发展和浸润过程，干扰其异常表达有望成为治疗宫颈癌的新思路和途径。