内源性大麻素系统在PCOS 大鼠模型子宫内膜中表达变化研究

王丽丽 崔 娜 赵志明 王 玮 张树成 王 宁 石翠格 郝桂敏*

1．河北医科大学第二医院( 石家庄，050000) 2．国家卫生计生委科学技术研究所

多囊卵巢综合征( PCOS) 是育龄女性常见的内分泌紊乱疾病，发生率5%～10%［1］。PCOS 患者妊娠易出现一些临床妊娠并发症［2］。一些研究证明PCOS 患者的子宫内膜功能和表型存在异常［3］。内源性大麻素系统( ECS) 可参与调控能量代谢、控制胰岛素分泌、维持血脂水平及性激素等，内源性大麻素受体1( CB1) 可表达于子宫及输卵管、卵巢的皮质和髓质［4-5］。内源性大麻素花生四烯酸乙醇胺( AEA) 信号通路参与胚胎发育和改善子宫内膜容受性，使种植前胚胎与子宫内膜种植窗期保持同步化［6］。ECS 信号过高或过低都会损害胎盘植入和分娩过程［7-8］。PCOS 女性代谢紊乱影响子宫内膜，可能增加妊娠并发症的风险，对后代造成影响［9］。本研究通过建立PCOS 大鼠模型，研究ECS 信号在子宫内膜组织中的表达变化，探究PCOS 患者子宫内膜蜕膜化调控机制，为临床诊治提供理论参考。

1 材料与方法

1．1 实验动物

4～5 周龄SD 大鼠30 只( 河北医科大学动物室购买，动物室温度21 ～22℃，湿度55%～65%，12 h/12h 光照黑暗周期) ，每笼3 ～5 只。动物可自由摄水摄食。

1．2 主要试剂及配制

来曲唑( 美国sigma) ;羧甲基纤维素( 北京索莱宝有限公司) ; 反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒( 日本Takara) 。1%羧甲基纤维素: 1g 羧甲基纤维素溶于100ml dd H2O 中。

1．3 PCOS 动物模型建立

将SD 大鼠随机分为3 组，每组7 只。①PCOS组:每天给予大鼠来曲唑( 1mg/kg 剂量) 灌胃，给药21 天，建立PCOS 大鼠模型; ②对照组: 给予同等体积的1%的羧甲基纤维素，连续定时灌服21 天;③空白组:不作任何处理。

1．4 标本数据采集与处理

每日对各组大鼠进行阴道涂片并HE 染色，判断动情周期变化。每3 日对各组大鼠称重并记录。给药21 天后，称重，用3%的戊巴比妥钠麻醉，用摘除眼球法取血，离心取血清，-20℃保存备用。取出双侧卵巢子宫分别称重后，一侧卵巢和子宫置于4%的多聚甲醛中固定，另一侧卵巢和子宫分别于-80℃冻存备用。

1．5 实时荧光定量PCR 分析

①目的基因引物的合成: 引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。引物序列见表1。提取大鼠子宫内膜组织总RNA 并检测其质量，进行反转录，荧光定量PCR 采用CFX96 序列检测系统。在含有10μl TB Green Premix Ex Taq II、6μl ddH2O、2μl cDNA 以及上、下游各0．8μl 的20μl 总反应体系中，进行如下扩 增:95 ℃预变性30s;95℃5s，60℃30s 共进行40 个循环。待测样品分别以内参基因( β?actin) 作为参照，每个样品重复3 次，以3 次得到的Ct 值的平均值为最终测定结果。

1．6 统计学分析

研究所得数据均利用SPSS 20．0 进行统计，数据均以均值±标准差( 珋x±s) 表示，行独立样本t 检验，P＜0．05 为差异具有统计学意义。

表1 基因引物序列

2 结果

2．1 PCOS 大鼠模型的建立

随着给药时间的延长，PCOS 组雌鼠的平均体重逐渐高于对照组，两周后高于对照组( P＜0．05) ;3周后PCOS 组子宫重量比对照组明显降低，卵巢重量明显升高( 均P＜0．05) 。见图1。

图1 PCOS 组和对照组体重、子宫和卵巢重量比较

2．2 动情周期

阴道涂片HE 染色结果观察动情周期显示，对照组动情周期规律，一般4～5 天。PCOS 组在给予来曲唑前两周动情周期规律，用药第12 天后大部分雌鼠无规律的动情周期，基本处于动情间期。见图2。

2．3 子宫、卵巢大体形态学观察

与对照组相比，PCOS 组子宫较细，卵巢体积较大。见图3、图4。

2．4 内源性大麻素系统分子在大鼠子宫中的表达

Real-time PCR 结果显示，与对照组比较，PCOS组内源性大麻素受体CB1 和内源性大麻素合成酶NAPEPLD 的表达量明显升高，水解酶FAAH 表达量明显降低( 均P＜0．05) ; 内源性大麻素受体CB2表达量无统计学差异( P＞0．05) 。见图4。

图2 对照组(A)和PCOS 组(B)老年期动情周期变化

图3 大鼠子宫大体形态图

图4 大鼠子宫内膜中内源性大麻素系统相关分子和NAPEPLD 的mRNA 表达量比较

3 讨论

育龄期PCOS 患者生育能力下降甚至不孕，主要表现:不孕，自然流产风险增加，妊娠期并发症风险增加。妊娠早期自发流产可能与滋养层入侵和胎盘形成异常有关［10-12］，导致滋养层入侵和胎盘异常的原因之一可能与子宫内膜蜕膜化异常。子宫内膜蜕膜化异常可能是PCOS 患者后续妊娠并发症发生的关键因素之一。因此，研究内源性大麻素在PCOS 子宫内膜中的表达，对进一步了解PCOS 患者妊娠并发症发病机理具有重要意义。

PCOS 患者多表现为排卵和胚胎着床及受孕障碍。目前尚无有效治疗方法。由于人群中病例材料获取十分困难，因此合适的动物模型对研究PCOS致病机理和诊疗策略极为必要。本研究选用SD 大鼠作为实验动物［13］，采用来曲唑建立PCOS 大鼠模型，灌胃给予来曲唑21 天后，PCOS 组体重明显高于对照组，动情周期发生紊乱，卵巢重量明显升高，子宫重量明显下降，与文献报道的PCOS 大鼠模型一致。说明本次研究成功建立了大鼠PCOS 模型。文献报道，来曲唑诱导PCOS 大鼠模型血清雌激素水平降低［14］。在卵巢去势的大鼠模型中，给予雌激素和孕酮后，子宫上皮和基层中FAAH 水平明显升高［15］。但在卵巢去势的大鼠模型中，单独给予雌激素后，子宫上皮和腺体中CB1、CB2、NAPE-PLD、FAAH 表达均明显升高［16］。说明在来曲唑诱导PCOS 大鼠模型中，可能是雌激素和孕激素共同参与调节其体内ECS 的表达。

Real-time PCR 结果显示，与对照组相比，PCOS组大鼠子宫内膜CB1 和NAPEPLD mRNA 表达量明显升高，FAAH mRNA 表达量明显降低。说明在PCOS 大鼠子宫内膜中内源性大麻素系统分子CB1、NAPEPLD 和FAAH 表达发生改变。说明子宫中ECS 的变化可能对后续妊娠蜕膜化产生重要影响。有研究表明小鼠子宫AEA 水平下降会增加子宫内膜容受性［17］。Fonseca 研究发现，在大鼠蜕膜化发育的阶段中，高水平NAPE-PLD 提高了AEA 水平，从而参与蜕膜重塑过程，待蜕膜化形成后FAAH 水平发生高表达，证实了AEA 代谢酶在早期妊娠信号传导中的关键调节作用［18-19］。

综上，本研究建立的PCOS 大鼠模型子宫中ECS 异常，该结果也为今后利用此模型研究ECS 与PCOS 致病机理，以及与妊娠结局关系提供基础。