肝郁脾虚证大鼠海马Notch信号通路改变及逍遥散的调节作用＊

刘玥芸，赵 歆，张 曼，闫秋莹，姜幼明，岳利峰，陈家旭＊＊

（1.北京中医药大学中医学院 北京 100029；2.北京中医药大学研究生院 北京 100029；3.北京中医药大学东直门医院 北京 100700）

慢性应激是抑郁、焦虑等情绪障碍的主要致病或诱发因素，本课题组在既往研究中，成功的运用慢性束缚应激方式建立了中医肝郁脾虚证大鼠模型，并结合中药逍遥散对其进行了系统的机制研究[1-3]。近年来研究发现抑郁、焦虑等疾病能明显引起海马神经元再生障碍的发生，表明慢性应激在直接损伤海马神经元的同时还可能引起海马神经元修复障碍，故神经细胞再生可做为抑郁症及抗抑郁药的最终作用靶点[4-8]，但其中涉及的信号传导通路有哪些，尚不明了。而Notch信号系统与中枢神经系统的发育密切相关，主要作用是调节神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的增殖、促神经胶质细胞的分化和学习记忆功能，可以作为一个良好的切入点。

综上，能导致中医肝郁脾虚证的慢性应激，通过不同的途径可以引起海马神经元损伤及再生障碍，而Notch信号通路是其中重要的一种，本实验选择Notch信号通路作为切入点，研究其在肝郁脾虚证模型大鼠海马中的变化，以期找到此通路的调节机制及中药逍遥散的干预作用，丰富证候生物学基础研究领域中的内容。

1 材料与方法

1.1 实验动物

图1 大鼠束缚造模

Sprague-Dawley(SD）成年雄性健康大鼠，清洁级，体质量180-200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证SCXK（京）2012-0001。饲养于屏障环境动物实验室（SPF级动物实验室），光照节律12L：12D（7：00-19：00），室温22 ± 2℃，相对湿度保持在30%-40%，喂常规颗粒饲料及饮用水。适应性喂养1周后进行实验。

1.2 实验药物

1.2.1 中药

按照《太平惠民和剂局方》原方比例购买柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜共4200 g。以上药材均购于北京同仁堂（毫州）饮片有限责任公司提供，根据《北京市中药炮制规范》，按原书配伍比例由中日友好医院中药制剂室煎煮、浓缩制成药粉810 g备用，使用时用去离子水溶解配制成混悬液，按大鼠用药量进行换算使用。

1.2.2 西药

盐酸氟西汀胶囊（生产厂：Patheon France；分包装厂：礼来苏州制药有限公司；批号：0955A）作为西药的阳性对照，规格20 mg·粒-1（成人用药量为20 mg·d-1），给药时按大鼠用药量进行换算。

1.3 主要试剂和仪器

1.3.1 主要试剂

多聚甲醛（北京鼎国昌盛生物有限公司），无水乙醇（分析纯）（北京化学试剂公司），二甲苯（分析纯）（北京化学试剂公司），焦油紫（sigma），苯酚（北京化学试剂公司），中性树胶（北京国药集团），Rabbit anti-NICD（abcam），Rabbit anti-Hes5（abcam），Rabbit anti-Hes1（Epitomics），Rabbit anti-Jag1（Epitomics），β-actin（Epitomics），山羊抗兔IgG（HRP）（北京康为世纪生物技术有限公司），组织蛋白抽提试剂盒（Pierce），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce），BSA（sigma），蛋白 maker（Fermentas），ECL化学发光试剂盒（Pierce），Tris-Glycine SDS（北京康为世纪生物技术有限公司），Tris-Glycine（北京康为世纪生物技术有限公司），TBS（北京康为世纪生物技术有限公司），SDS-Page凝胶制备试剂盒（北京康为世纪生物技术有限公司），SDS-Page Loading Buffer（北京康为世纪生物技术有限公司），总RNA提取试剂盒（Qiagen），cDNA反转录试剂盒（Fermentas），SYBR Green PCR Master Mix（ABI），琼脂糖（sigma），GoldStar Taq DNA Polymerase（康为世纪），100bp-1000bp DNA Ladder（康为世纪），5×RNA Loading Buffer（康为世纪）。

1.3.2 主要仪器设备

全自动组织脱水机（Leica ASP300S），全自动石蜡包埋机（Leica EG1150H），轮转式石蜡切片机（Leica RM2245），电热恒温干燥箱（Leica），防脱载玻片（世泰），光学显微镜（Nikon E200 Nikon），数码相机（Nikon 4500 Nikon），Imagepro Plus5.0（Media Cybernetics），脱色摇床TS-1型（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司），Western电泳印迹系统（Biometra），微量加样抢（Eppendorf），凝胶成像系统（KODAK），PVDF膜（MilliPor），普通PCR仪（Eppendorf），DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司），凝胶电泳系统（Biometra），Real-time qPCR 仪（ABI），紫外分光光度仪（UNIC）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组

48只大鼠适应性饲养1周，根据体质量将大鼠随机分为4组，每组12只，即正常组对照（Control Group）、模型组（Model Group）、模型+逍遥散组（Model+XYS Group），模型+氟西汀组（Model+Fluoxetine Group）。群笼饲养，4只·笼-1。

1.4.2 模型制备

除正常组以外的各组大鼠均用束缚架进行捆绑束缚造模，3 h·d-1，时间随机，连续21天。正常组不予束缚，但在其他组进行束缚的时间内禁食水。大鼠束缚架为木质结构，底座宽10 cm、长20 cm、厚1 cm。上面束缚台长22 cm，宽6.6 cm，前端有小架可固定大鼠头部，束缚台两侧分别为两条可调节的粘贴软带，用于束缚大鼠的胸部和腹部（图1）。

1.4.3 给药

造模开始后同时灌胃给药（每次束缚前30 min），1次·d-1，给药体积为1 mL·100g-1体质量，人体用药量换算成大鼠等效剂量，给药量为逍遥散2.11 g·kg-1体质量，氟西汀2 mg·kg-1体质量，模型组及正常组给予等体积去离子水。

1.4.4 取材

常规用10%水合氯醛麻醉大鼠，其中6只给予生理盐水和4%多聚甲醛心脏灌注进行前固定后，铡刀断头，冰上取脑，再立即置4℃的4%多聚甲醛，固定72小时后，取材做石蜡包埋；另外6只麻醉后直接冰上取脑，迅速剥离双侧海马，分成2份置于冻存管中，投入液氮，后移至-80℃冰箱中保存，分别备用于蛋白质的提取和总RNA的提取。

1.4.5 尼氏染色

（1）尼氏染液的配制：

取4 g苯酚加入80 mL纯水中配成苯酚水溶液，取焦油紫1 g加入苯酚水溶液中，再加入95%乙醇20 mL，混合配制成100 mL焦油紫原液。用时取适量，再用20%乙醇稀释20倍，即尼氏染色液。

（2）石蜡切片制备：

①冲洗：从多聚甲醛中取出脑组织，在双蒸水下冲洗1 min；②脱水与透明：将鼠脑组织沿囟门，切出约4 mm厚的冠状切片进行脱水与透明。脱水顺序依次为：70%乙醇20 min，80%乙醇20 min，90%乙醇20 min，95%乙醇20 min，无水乙醇15 min，二甲苯20 min，二甲苯20分钟；③浸蜡：设置自动脱水浸蜡机的温度为58℃， 浸蜡时间设置依次为：蜡Ⅰ30 min，蜡Ⅱ30 min，蜡III30 min；④包埋：在全自动石蜡包埋机中进行，将石蜡倒入包埋器中进行预熔，后将组织块放入完全没住，将包埋块放置一旁冷却；⑤切片：将包埋块稍作修整，置于轮转式切片机上进行切片，切片刀角度设置为7°，切片厚度设置为7 μm，进行切片；⑥展片与贴片：将切好的蜡带用毛笔挑起，放入温度为42℃的展片锅内（加入双蒸水预热）展平组织切片。将防脱载玻片以45度角伸入水内，轻轻挑起组织切片，使其贴在载玻片外1/3处；⑦烤片：将载玻片置于烘箱中50℃烘干。

（3）尼氏染色

①烤片：烤箱设置为70℃，载玻片置于内烤30 min；②脱蜡：取出载玻片，顺序经过二甲苯I15 min、二甲苯Ⅱ20 min；③水化：载玻片顺序经过无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各5 min，再用入双蒸水中3 min进行水化；④染色：将载玻片放入尼氏染色液中，置于37℃温箱中约8 min。取出，蒸馏水冲洗1 min；⑤分化：将载玻片置于在95%乙醇中，快速分化60 s；⑥脱水透明：常规脱水透明，载玻片顺序经过无水乙醇I、无水乙醇Ⅱ各1 min，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各 3 min；⑦封片：将中性树胶一小滴滴于盖玻片上，45°角缓慢与载玻片粘合，注意不要产生气泡，封住标本，晾干，准备光镜下观察。

1.4.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）

（1）总蛋白的提取：

将海马组织取出解冻，加入组织蛋白抽提试剂盒抽提试剂进行裂解，手持电动匀浆器匀浆，冰上放置30 min，后4℃、12000 r·min-1离心15 min，所得上清液即为总蛋白。

（2）蛋白定量：

采用BCA法蛋白定量，按照试剂盒说明操作，然后用酶标仪进行A562测定，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

（3）蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳

①首先按照SDS-Page凝胶制备试剂盒说明制备相应的蛋白电泳凝胶；②加样：样本蛋白与5×样品缓冲液以4∶l体积混匀，样本蛋白含量50 μg·孔-1，保证各孔上样蛋白含量相同;第一孔加入标记Marker 5 μl。样本混匀，95℃水浴5 min，冷却后依顺序到样品上样孔中；③电泳：浓缩胶电泳电压设置为80 V；观测到溴酚蓝进入分离胶后，提高电压到120 V，稳定电压继续电泳90 min，直到溴酚蓝到达分离胶底部；④湿法转膜：结束电泳后，将胶和PVDF膜夹好放入电转系统中，以120 mA转移90 min；⑤封闭、洗脱：将脱脂奶粉加入TBST溶液中成配置成5%溶液，室温摇2 h，然后用TBST洗5 min×3次；⑥结合一抗：将PVDF膜置于杂交袋内，以每1 cm PVDF膜加入0.1 mL一抗为量（一抗浓度为NICD：1∶200，Hes1：1∶400，Hes5：1∶400，Jad：1∶1000，β-actin：1∶2000），封闭杂交袋，4℃摇床过夜；⑦孵育二抗：弃去杂交液，TBS洗膜3次，每次10 min。每1 cm PVDF膜加入0.1 ml二抗为量（二抗浓度为1∶4000），封闭杂交袋，室温下摇床摇动孵育1小时；⑧显影：TBST洗膜3次，每次10 min；吸干多余的TBST，用ECL发光液显影。

（4）实验结果图像分析

以β-actin作为内参照，凝胶成像系统采集图像，用图像处理软件分析各蛋白条带的灰度值，将内参灰度值与各组待测蛋白的灰度值作比较，获得待测蛋白的相对灰度比值。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 实时荧光定量PCR（Real time qPCR）

（1）总RNA的提取

取约100 mg组织置于RNA提取试剂盒所提供的试管中，用手持电动匀浆器进行匀浆，按照试剂盒说明添加试剂提取总RNA，将提取出的总RNA储存于-80℃冰箱中备用。

（2）RNA浓度与纯度检测

吸取1 μL总RNA加无RNA酶水至20 μL，用紫外分光光度计分别测定A260、A280值，以无RNA酶水调零。A260和A28O的比值能反映RNA中蛋白质等有机物污染程度，当A260/A280在1.8-2.0之间表明RNA质量较好，无污染或降解，故我们将A260和A28O比值在1.8-2.0之间RNA样品用于后续实验，比值低于1.5或高于2.2者弃去。根据A260的值计算RNA浓度：A260x稀释倍数x40/1000.

（3）实时荧光定量PCR反应

①引物合成，本实验使用华大基因公司设计合成的引物，序列如下（表1）；②逆转录，cDNA第一链合成采用Fermentas公司的逆转录试剂盒操作方法进行，放入普通PCR仪进行逆转录，温度为42℃60 min，70℃5 min。产物-20℃保存备用；

③ 实时荧光定量PCR，反应体系：5×SYBR Green I PCR buffer 5 μl，上、下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，dNTP（10 mM）1 μL，Taq 酶（3U·μL-1）1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL，总体积25 μL。

反应条件：

NICD：95℃ 10 min，35个 PCR 循环（95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Jag1：95℃ 10 min，35个PCR 循环（95℃ 30 s、58℃30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes1：95℃ 10 min，35 个 PCR 循环（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes5：95℃ 10 min，35 个 PCR 循环（95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

β-actin：95℃ 10 min，35个PCR 循环（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

（4）实验结果分析

通过熔解曲线分析定量PCR质量。样品的目的基因和管家基因β-actin分别进行RT-qPCR反应。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

1.5 统计学方法

运用SPSS21.0软件，对数据做正态性检验和方差齐性检验，两项均符合，采用单因素方差分析（One-Way，ANOVA）进行统计计算。若数据不正态或方差不齐，则采用K个独立样本的非参数检验逐项统计。

2 结果

2.1 尼氏染色

2.1.1 尼氏染色形态观察

尼氏染色显示正常组大鼠海马CA1、CA3、齿状回区可见锥体细胞、颗粒细胞，数量多，排列紧密，神经元细胞核呈椭圆形、圆形，染成淡紫，细胞核仁能清晰可见，胞浆透明，细胞形态正常，尼氏小体染色后呈块状（形如虎斑）或颗粒状，在正常组中尼氏小体丰富、分布正常。模型组大鼠海马CA1、CA3、齿状回锥体细胞、颗粒细胞排列散乱，形态不规则，部分细胞核轮廓模糊、界限不清，胞浆中尼氏小体减少；逍遥散和氟西汀组大鼠海马锥体细胞和颗粒细胞仍很丰富，神经元细胞核轮廓尚清楚，胞浆尼氏小体有所减少，但神经元在形态改变上较模型组为轻（图2）。

2.1.2 尼氏小体计数

与正常组相比，模型组尼氏小体数明显减少（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组的的尼氏体都显著增多（P＜0.01），提示给药后能不同程度的减轻尼氏小体在海马中的丢失情况，改善神经元细胞的状态（图3）。

2.2 蛋白免疫印迹

与正常组相比，模型组Notch信号通路相关蛋白表达均显著降低（P＜ 0.01），给药组的NICD、Hes1、Hes5蛋白也显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，给药组的NICD、Hes5、Jag1蛋白表达均上升（P＜0.05或P＜0.01），Hes1蛋白表达中，只有氟西汀组与模型组有显著差异（P＜ 0.05）（图4（a-d））。

图2 尼氏染色

2.3 实时荧光定量PCR

图3 尼氏小体计数

与正常组相比，模型组各基因mRNA表达量均降低（P＜0.01），给药组只有NICD mRNA表达量都降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），Hes1、Hes5无明显差异，Jad1只有逍遥散组降低明显（P＜0.05），而氟西汀组已经被逆转。与模型组相比，给药组的NICD、Hes1、Hes5 mRNA表达均有显著上升（P＜0.05，P＜0.01），Jag1只有氟西汀组显著上升（P＜0.01），逍遥散组无显著差异（图5（a-d））。

3 讨论

图4 Notch通路各蛋白western bolt结果

图5 Notch通路各分子基因表达情况

尼氏体主要由平行排列的粗面内质网和核糖体组成，主要功能是合成蛋白质，作为神经活动时所需，如细胞中的某些成分的更新以及产生神经递质有关的蛋白质和酶类。轴突端的蛋白质大都来自胞体的尼氏体。神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新的蛋白质以补充这种消耗。一旦尼氏体丢失，就会通过不同途径引起神经细胞结构和功能失调。以前的大量研究已经证明，慢性应激会引起脑结构和功能的改变，特别是海马区神经元丢失，树突减少，突触终端结构改变和神经元再生抑制等[9]，我们的研究结果与此一致。海马神经元形态的改变和尼氏体的丢失说明慢性束缚应激所致肝郁脾虚证大鼠中枢神经系统确实受到了影响。模型组尼氏小体明显丢失，显示了在慢性应激过程中海马神经元产生了损伤和凋亡，相应的神经细胞合成蛋白质的功能也会受到影响。而经过中药逍遥散和西药氟西汀干预过后，尼氏小体丢失的情况得到了明显改善，提示这几种药物能使神经元趋向于修复。

Notch信号系统有很强的分化抑制活性，在成年脑组织主要发挥促进神经干细胞增殖的作用。本研究结果显示，大鼠束缚应激造模后，其海马Notch通路的功能呈下调趋势；药物干预后，各给药组大鼠海马Notch通路各因子（NICD、Hes5、Jag1）蛋白表达显著上升。NICD是Notch通路的胞内活性片段，代表信号系统的激活，该因子的表达增加强有力地提示通路功能的上调。Hesl、Hes5作为Notch信号途径的靶基因，较之其他因子（如Hes3），与维持神经干细胞在未分化状态的联系更为紧密。并且发现在哺乳动物大脑发育中Hes5可以作为特定标记物来区分神经干细胞与其他祖细胞[10]。因而，Hesl和Hes5的表达增加，与促进神经干细胞增殖有密切关系。Jagl可通过作用于Notch受体和其下游效应器（信号分子Shh等）来促进神经干细胞的生存[11]。Shh是一种分泌蛋白，具有促进有丝分裂的功能，Jagl可诱导其的长期表达。Shh缺失的大鼠，海马齿状回的细胞增殖和神经发生严重抑制[12]。Jagl的表达增加，可能通过Shh发挥其促进海马神经干细胞增殖的作用。以上Notch信号通路各因子对神经干细胞的促增殖特性，与本实验中逍遥散提取物干预后Notch系统因子表达的增加，提示该通路可能与逍遥散改善抑郁大鼠海马的神经再生有关，继而缓解大鼠肝郁脾虚症状。

对照本实验western blot与RT qPCR的结果可以发现，XYS干预下的Jag1基因并未明显上调，但其相对应的蛋白表达却明显上调；相反的在XYS干预下Hes1基因出现了明显上调，但其相应的蛋白表达却没有上调。推测可能有以下几个原因：①基因与蛋白表达情况相反指出逍遥散在Notch信号通路上的作用靶点可能存在于直接上调Jag1蛋白中，及阻断已经上调了的Hes1基因的下游信号转导中。即基因上调或下调的信号在传递过程中被干扰，从而直接引起蛋白合成与基因情况不符；②提示逍遥散抗抑郁的机制与氟西汀不同；③不排除基因表达不稳定以及调控滞后的可能性。