食品微生物沙门菌的检测

◎ 孙 蕾

（山东恒诚检测科技有限公司，山东 莱州 261400）

1 检验沙门菌的原因

在食品中毒事件中，由细菌引发的疾病约占65%，而细菌中由沙门菌引起的食物中毒居于首位。资料显示，在引起沙门菌中毒的食品中，肉类等动物性产品占到90%以上。因动物性产品中含有丰富的营养成分，非常利于沙门菌的生长繁殖，如果摄入含有大量沙门菌的动物性产品，就会引发细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。此外，沙门菌还有部分菌种在自然环境中发生变异，产生了类似耐药性的海德堡沙门菌。

2 沙门菌的传播媒介

2.1 肉及肉制品

据统计，肉及其制品中沙门菌检出率：中国最高，为1.1%～39.5%；其次为美国，检出率为20%～25%；第三为日本，检出率为10.3%；第四为英国，检出率为9.9%。

2.2 蛋及蛋制品

目前，国内蛋及其制品沙门菌检出率为3.9%～43.7%，近年来由于蛋类污染造成细菌感染人数呈上升趋势。

2.3 加工、运输、销售环境

在加工、运输、出售过程中，食品也容易被沙门菌污染。因为，沙门菌在粪便、土壤、食品、水中可存活长达2年之久。

2.4 人为因素

人也可以作为沙门菌的传染载体。例如，国外有个厨师感染了沙门菌后传染了很多人。沙门菌是在人的病灶中生存，但是作为载体的人自己是没有感觉的。另外，在恢复期的患者和无症状的带菌者也可能成为常见的传染源。

3 沙门菌感染的临床表现

沙门菌感染主要表现形式有3种：胃肠型、伤寒型、败血症型。①胃肠炎型特点：起病急骤，伴有发热症状，体温一般在38～39 ℃，常伴有恶心、呕吐，腹痛，腹泻。②伤寒型特点：或有发热症状，亦可有相对缓脉，常见腹泻。③败血症型特点：多见于患有慢性疾病的成人、婴幼儿、儿童等。起病急骤，有畏寒、发热、出汗及轻重不等的胃肠道症状。

4 检验沙门菌的实验室要求

检验沙门菌的实验室要求是二级生物安全实验室及二级生物安全柜（在负压的情况下防止致病微生物的气溶胶飘离实验室对人员及环境造成污染）。

5 沙门菌的常规检验方法

沙门菌大小（0.6～1.0）μm×（2～3）μm，无芽孢，一般有鞭毛（鸡沙门菌除外），无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为35～37 ℃，最适pH值为6.8～7.8。目前，至少有67种O抗原和2 000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。沙门菌常用生化检测方法有三糖铁（TSI），尿素酶试验，吲哚试验，VP试验、赖氨酸脱羧酶试验、丙二酸盐试验和ONPG试验。

6 国内外沙门菌检测方法对比。

国内常用检测方法：国家标准、行业标准。

国外常见检测方法：FDA（Food & Drug Administration），AOAC（Association of Official Analytical Chemists），FSIS（FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE），ISO。

7 沙门菌的快速检验手段

目前，沙门菌的快速检验手段主要分为PCR技术和LAMP技术两大类。①PCR技术中，荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性好，是目前微生物检测最精准的方法。但缺点是操作复杂，对所用仪器和操作人员要求高，不适合基层使用或现场快速诊断。②LAMP技术，即环介导等温扩增反应，此方法的优点除了特异性高、灵敏度高之外，与PCR技术相比，操作简单，对仪器设备要求低，结果呈现简单，可通过肉眼观察是否浑浊或荧光反应来进行判断，简单快捷，极其适合基层使用。下面着重就LAMP的一些情况作简单说明。

7.1 LAMP技术的优缺点

LAMP方法的优点：操作简单，只需将反应液、酶、引物和模板定量加入PCR管中；灵敏度高（比荧光PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（1 h内完成反应）；不需使用特殊仪器，通过肉眼观察反应管是否变为白色浑浊就能判断结果。

LAMP方法的缺点：密封不好，易形成气溶胶污染，加之目前国内实验室水平参差不齐，不能严格区分假阳性反应，建议在快检试剂盒使用时采用实时浑浊仪；同时，对引物设计要求比较高，某些基因检测并不适合该方法。

7.2 目前国内实验室同类检测设配使用情况

目前，国内基因诊断常采用PCR方法，涉及PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2万～3万也能买到，贵的20多万。条件比较好的实验室和国家机构也有采用荧光定量PCR方法的，但仪器价格较高，一台荧光定量PCR仪的价格在20万以上。

LAMP产品在临床诊断中是不需要特殊仪器的，但临床使用的成品试剂盒有赖于和国内拥有毒株的老师合作开发针对中国国情的疾病LAMP引物，在研发过程中由于涉及引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化，需要用一种量化的方式去帮助研究者分析选择数据，推荐使用实时基因扩增仪。

8 沙门菌的存活力

在潮湿的环境中，沙门菌的存活率更高，干燥环境中存活率低，但最近国外科学家研究发现细菌表面附着的生物膜会对沙门菌形成一种保护性外膜，这会对沙门菌存活起到保护作用，所以沙门菌的存活力比想象中更为强大，具有生物保护膜的沙门菌在干燥环境中存活力大为增强，之前认为在坚果、谷物、香料、奶粉和宠物食品等干性食品不可能存在该菌种的食品中也发现了沙门菌污染，它们能够在长期存放环境中生存下来，所以要强调更好的卫生条件，研究更新的应对策略。

9 沙门菌检测中需要注意的问题

沙门菌检测国家标准为GB4789.4-2010《食品卫生学微生物检验 沙门菌检验》。

检测中出现的主要问题为培养基和显色琼脂的选择。沙门菌的种类比较多，为了防止漏检，一般是强选择性的培养基搭配选择性弱一点的培养基，国标里面的TTB比SC选择性要强，BS也比XLD的选择性强；SC更适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌增菌，最适增菌温度为36 ℃，TTB更适合其他沙门菌增菌，最适增菌温度为42 ℃，因为沙门菌有2 000多个菌型，一种增菌液不可能适合所有的沙门菌生长，因此沙门菌增菌要同时用两种培养基增菌。而沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色，而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。另外，增菌一般使用SC增菌液、SF增菌液（如果样品是食品，那么还需要用BP增菌液进行预增菌）；分离培养一般使用SS琼脂、XLD琼脂、BS琼脂、沙门菌显色琼脂等。